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研究背景胰腺癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,是所有类型的实体肿瘤中最具有侵袭破坏性的肿瘤,目前胰腺癌已经成为危害国民健康的一大忧患。由于胰腺癌患者早期缺乏特异的临床表现及早期诊断标志物,发现时候大部分已是晚期,因伴随肿瘤的远端转移与局部广泛侵润,患者生存时间极短。虽然随着胰腺癌手术技术水平的不断提高,手术应用越来越广泛,然而,也只有10%-20%的早期胰腺癌患者可以行手术治疗;虽然临床研发的化疗药物层出不穷,但因胰腺癌存在多种化疗药物抵抗与耐药,导致患者治疗效果十分不佳。因此,更深入的探讨了解胰腺癌的发病机制,寻找新的胰腺癌特异有效的肿瘤标准物,对提高患者的早期诊断及疗效、改善预后具有深远意义。研究目的本研究旨在分析miR-365在胰腺癌中表达及其作为胰腺癌肿瘤标志物的可能性,研究miR-365在胰腺癌细胞生长增殖及侵袭中的作用。通过收集临床胰腺癌患者组织、血清及临床病理资料,进行以下几个问题的探讨:1、miR-365在胰腺癌患者癌组织及癌旁正常组织、胰腺癌患者及健康体检者血清表达水平;2、评估血清miR-365区分胰腺癌患者与健康体检者的效能。3、体外细胞实验观察胰腺癌细胞系及正常胰腺细胞mi R-365表达水平;4、上调或下调胰腺癌细胞中miR-365表达,观察对胰腺癌细胞增殖及侵袭的影响;5通过生物信息学软件分析及荧光素酶报告基因预测与验证mi R-365的下游靶基因。材料与方法1,本研究90例胰腺癌患者癌组织标本及其癌旁正常组织,均为2013年8月至2016年8月郑州大学第一附属医院肝胆外科收治的住院手术患者,获得患者本人的同意,均未接受任何治疗,排除其他系统肿瘤,所有的胰腺癌组织经过病理确诊证实,癌旁组织经病理证实无肿瘤细胞浸润。选取三株胰腺癌细胞系与一株正常胰腺细胞系,采用qRT-PCR分别检测胰腺癌组织与癌旁组织、胰腺癌细胞系及正常胰腺细胞系miR-365表达水平。分析比较胰腺癌患者组织miR-365表达水平与肿瘤的分期、转移等关系。2,本研究70例胰腺癌患者均为2010年11月至2013年11月郑州大学第一附属医院肝胆外科收治的住院手术患者,征得患者本人同意,60例健康体检者作为健康对照,均抽取3mL外周血,离心收集血清。qRT-PCR检测胰腺癌患者与健康体检者血清miR-365表达水平;采用ROC曲线评估血清miR-365区分胰腺癌与健康对照的敏感度与特异性,COX回归分析胰腺癌患者总体生存的独立预后因子,采用卡方χ2检验分析胰腺癌患者血清miR-365相对表达量与胰腺癌患者临床病理之间的关系。3,MTT及Transwell法观察胰腺癌细胞转染miR-365后细胞增殖及侵袭的变化。信息生物学软件分析及荧光素酶报告基因预测并验证miR-365靶基因,Western blot观察上调mi R-365对其靶基因蛋白表达的影响。研究结果1,胰腺癌患者癌组织miR-365的表达及临床意义qRT-PCR分析胰腺癌组织及正常癌旁组织、胰腺癌细胞系及正常胰腺细胞系中miR-365的表达水平,结果发现相对于正常癌旁组织及正常胰腺细胞系,miR-365在胰腺癌组织及胰腺癌细胞系表达显著下调。本研究将胰腺癌组织miR-365表达水平与胰腺癌患者临床病理信息进行分析,以探讨胰腺癌患者癌组织中miR-365的表达水平与胰腺癌恶性进展的关系。结果显示,胰腺癌组织miR-365表达水平与肿瘤大小与位置均无相关性(P>0.05)。发生转移的胰腺癌患者癌组织miR-365表达水平显著低于未发生转移的患者(P<0.05),肿瘤高分化的胰腺癌患者癌组织miR-365表达水平显著高于低分化的患者(P<0.05)。2,胰腺癌患者血清中miR-365的表达水平及其潜在的诊断价值利用qRT-PCR检测胰腺癌患者及健康体检者血清中miR-365表达水平,结果显示,胰腺癌患者血清miR-365表达水平(1.18±0.07)显著低于健康体检者(4.14±0.168),差异显著统计学意义(P<0.001),胰腺癌患者血清miR-365表达模式,与胰腺癌患者癌组织及胰腺癌细胞水平表达模式一致。胰腺癌患者血清miR-365表达水平与胰腺癌肿瘤临床转移情况及肿瘤分化、分期密切相关,进一步提示miR-365可能在胰腺癌恶性进展中发挥至关重要的作用。血清miR-365可对健康体检者与胰腺癌患者进行区别诊断,具有82.9%特异性,和78.3%的敏感度。相对于miR-365低表达胰腺癌患者,血清mi R-365高表达组患者术后总体生存时间更长,提示血清miR-365可对胰腺癌患者术后总体生存进行评估。COX回归分析显示胰腺癌预后相关因素miR-365表达水平(RR=3.59,95%CI:1.81-7.36,P=0.001),临床分期(RR=1.82,95%CI:1.12-4.87,P=0.005),淋巴结转移状态(RR=1.11,95%CI:1.04-3.66,P=0.004)是影响胰腺癌患者总体生存的独立预后因子。3,miR-365对胰腺癌侵袭的影响及下游靶基因预测胰腺癌细胞AsPC-1分别进行anti-miR-365及anti-miR-NC、miR-365 mimic及miR-NC mimic转染,通过MTT及Transwell法观察转染后胰腺癌细胞AsPC-1增殖及侵袭改变。结果显示,相对于mi R-NC mimic组,mi R-365 mimic组胰腺癌AsPC-1细胞增殖及侵袭受到显著抑制(P<0.05,P<0.05)。通过信息生物学软件分析及荧光素酶报告基因预测并验证了,FAM230A是miR-365下游靶基因,Western Blotting实验结果显示,相对于miR-NC mimic组,miR-365 mimic组胰腺癌AsPC-1细胞FAM230A蛋白表达水平显著被抑制。结论1,胰腺癌患者癌组织及血清中miR-365表达水平显著低于正常癌旁组织及健康体检者,miR-365在胰腺癌细胞系中呈现下调模式,在细胞水平验证了miR-365在胰腺癌中低表达。2,胰腺癌患者癌组织及血清中miR-365表达水平与胰腺癌患者远端转移、临床分期密切相关。血清miR-365可对胰腺癌患者与健康人进行诊断区分,具有较高的特异性与敏感度;同时,血清miR-365可作为预测胰腺癌患者总体生存的一个独立预后因子。3,胰腺癌细胞系过表达miR-365后,可显著抑制胰腺癌细胞增殖及侵袭。此外,生物信息学及荧光素酶基因报告分别预测与证实了,FAM230A是胰腺癌中miR-365的下游靶基因;过表达mi R-365可显著抑制FAM230A蛋白表达,提示miR-365可能通过调控FAM230A,参与胰腺癌细胞生长及侵袭。