论文部分内容阅读
研究背景/目的:
骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是源于骨髓的成体干细胞,具有多向分化潜能,且取材容易,易于在体外培养扩增,免疫源性低,便于外源基因的转染和表达调控。随着研究的不断深入,人们发现MSCs在体内外都具有肝样细胞分化的潜能。将MSCs直接输入体内,可以在发生损伤病变的肝脏内分化为肝细胞;在体外特定的诱导条件下,MSCs也可以定向分化为肝样细胞。
原代肝细胞难以在体外扩增培养,而且常常不能维持正常的生理功能。诱导分化后的肝样细胞则能够大量扩增,又具备肝细胞分泌和解毒的功能,将能很好地替代正常肝细胞在科研和临床上的应用:①为肝脏疾病的细胞移植治疗和基因治疗提供可利用的细胞库;②诱导后的肝样细胞可制成人工肝脏体外生物反应器,一方面帮助治疗肝功能衰竭的病人,另一方面生产肝细胞分泌的多种蛋白、因子;⑧用于构建药代动力学反应器,检测药物肝代谢途径和毒性。
目前,如何创造最优化的诱导分化环境,最大效率地获取分化成熟的肝样细胞,仍然面临巨大的挑战。本研究把大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)作为研究对象,以最大程度地获取肝样分化细胞为宗旨,比较并验证不同培养条件下rMSCs的分化效率。目的在于探索出更优化的诱导分化条件,最终应用于诱导人MSCs的肝样分化,为临床肝功能衰竭的细胞和基因治疗、生物人工肝体外生物反应器以及药代动力学反应器提供种子细胞。
方法:
第一章:肝细胞共培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的研究。
1、分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)。
2、通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-GFP,脂质体介导转染PT67包装细胞,获得完整的重组逆转录病毒。
3、病毒感染rMSCs,筛选出表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞克隆rMSCs-GFP,扩增培养,并在激光共聚焦显微镜下检测GFP的表达。
4、分离原代大鼠肝细胞,与rMSCs-GFP共培养,并以肝细胞生长因子(HGF)处理组作为对照(20ng/mL)。
5、倒置显微镜下观察不同时间点细胞的形态和生长状况。
6、在共培养第3、7、14和21天,用流式细胞仪分选器分离出表达GFP的rMSCs。
7、以MTT法检测共培养21天后分选所得rMSCs的增殖活性。
8、分别以RT-PCR法和免疫荧光技术检测分选获取rMSCs的ALB、AFP和CK-18在mRNA和蛋白水平上的表达情况。
9、以Periodic acid-Schiff法检测细胞内肝糖原的表达。
第二章:肝细胞生长因子和悬滴培养共同诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的研究。
1、通过悬滴的方式使rMSCs形成细胞球,提供一种三维培养环境,同时加入HGF作为诱导因子。
2、培养第7、14和21天后,以RT-PCR法和免疫荧光技术检测rMSCs的ALB、APF和CK-18在mRNA和蛋白水平上的表达情况。
3、ELISA检测培养液上清中ALB的分泌。
第三章:表达人肝细胞生长因子的大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的研究。
1、通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pL,NCX2-hHGF,脂质体介导转染PT67包装细胞,获得重组逆转录病毒。
2、病毒感染rMSCs,筛选出表达址tGF的阳性克隆(rMSCs-hHGF),扩增培养。 3、RT-PCR法检测rMSCs内hHGF基因的mRNA表达;免疫荧光法检测hHGF蛋白表达;ELISA检测细胞培养上清中hHGF蛋白的分泌。
4、悬滴培养rMSCs-hHGF,在培养7、14和21天后,以RT-PCR法和免疫荧光技术检测细胞的ALB、APF和CK-18在mRNA和蛋白水平上的表达情况。
5、ELISA检测培养液上清中ALB的分泌。
结果:
第一章:肝细胞共培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的研究。
构建了重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-GFP,包装为具有感染力的逆转录病毒后,成功感染rMSCs,获得稳定表达GFP的细胞株。
在rMSCs-GFP与原代肝细胞共培养的过程中,细胞由长梭形、贴壁生长转变为多边形、圆形悬浮生长,并相互聚集成团块、球形结构,同时也保持了良好的细胞活性和增殖力。优化流式细胞仪分选方案,获取了高纯度的rMSCs-GFP(98﹪±)。
RT-PCR结果显示,与肝细胞共培养的rMSCs-GFP在第3天就开始在基因水平上表达ALB、AFP和CKl8,并在此后的第7、14和21天表达增强;HGF处理组则在第14天才有较弱的表达。
免疫荧光技术检测结果显示,在第3到21天中,与肝细胞共培养的rMSCs-GFP呈现ALB和CK18较强阳性表达,而AFP则较弱表达;HGF处理组中,直到第21天才出现细胞内ALB、AFP和CK18的弱阳性表达。
rMSCs-GFP与肝细胞共培养的第7天就具备了糖原储存的功能;而在整个培养过程中,HGF诱导后,rMSCs并不具备该功能。
第二章:肝细胞生长因子和悬滴培养共同诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的研究。
rMSCs经过悬滴培养后,细胞紧密聚集成球形,组织切片显示细胞球内部呈现管状中空。RT-PCR结果显示,EGF悬滴培养的rMSCs,在第7天出现了ALB、AFP和CK-18 mRNA的弱阳性表达,其中ALB表达相对较强。EGF+HGF悬滴培养的rMSCs,在第7天即出现ALB和CK-18 mRNA的强阳性表达,而AFP则表达较弱,并持续到第21天。对比EGF悬滴培养,CK-18 mRNA的表达也相对较强。相应地,EGF悬滴培养rMSCs,细胞内AFP阳性表达出现在第14天,第21天时有所增强,ALB在整个培养过程都呈现弱阳性表达,且有不断增强的趋势,而CK-18的蛋白表达则一直呈现阴性;EGF+HGF悬滴培养rMSCs,细胞内AFP在第14天呈现阳性表达,并在第21天时表达增强,而ALB和CK-18这两种蛋白,在第7天就呈现较强阳性表达,直到21天为强阳性表达。
从第1周到第3周,ELISA检测到EGF+HGF悬滴培养后rMSCs的ALB分泌量分别为50.25±5.32,55.03±7.45和54.92±3.18(ng/dish/d);而EGF悬滴培养则分别为0.52±0.44,0.88±1.33和9.7±4.60(ng/dish/d)。两者在不同时间点上的分泌量具有统计学上显著差异(p<0.01)。
第三章:表达人肝细胞生长因子的大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的研究。
构建了重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-hHGF,包装为具有感染力的逆转录病毒,成功感染rMSCs,经过G418筛选获得稳定表达hHGF的细胞株。RT-PCR和免疫荧光检测都证实rMSCs-hHGF有hHGF mRNA和蛋白表达,ELISA检测培养上清也说明该细胞能够将hHGF分泌到胞外,且分泌量保持在一恒定水平(123.71±8.81 ng/ml)。
RT-PCR结果显示,EGF悬滴培养的rMSCs-hHGF,在第7天即可出现ALB、AFP和CK-18 mRNA的阳性表达,其中ALB表达最强;细胞内AFP在第21天始出现阳性表达,而ALB和CK-18这两种蛋白,在第7天就呈现较强阳性表达,并持续到第21天。
从第1周到第3周,ELISA检测到EGF悬滴培养后rMSCs-hHGF的ALB分泌量分别为46.32±3.31,42.17±8.53和50.06±5.78(ng/dish/d)。
结论:
与肝细胞共培养的过程中,rMSCs在分化为肝样细胞的同时,形成球形或团块状立体结构,我们就考虑该立体结构有可能促进和维持rMSCs的分化。于是,我们通过悬滴培养的方法,为rMSCs创造一种球形三维培养微环境,在EGF和/或HGF的作用下,成功地诱导了rMSCs分化为肝样细胞。不同的诱导因子对rMSCs具有不同的诱导效应:而HGF在此过程中起着重要作用。因此,我们以逆转录病毒介导,把hHGF基因导入rMSCs中,继而通过悬滴培养的方式又成功地诱导其向肝样细胞的方向分化。综上所述,立体三维空间培养为MSCs的肝样细胞分化提供了优化的诱导微环境,有效地提高了分化效率,并帮助维持其分化成熟状态。