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结肠癌是世界范围内高发病率,高致死率的恶性肿瘤之一。根据2018年全球癌症统计报告报道,2018年全球新增结直肠癌病例约180万人,致死率接近50%。有研究认为,结肠癌致死率高的原因之一是癌细胞的保护性自噬,即癌细胞快速增殖消耗大量营养,导致部分癌细胞处于营养缺乏的微环境,这些癌细胞通过自噬途径吞噬破碎的细胞器回收营养,以维持其快速增殖。如果能有效地抑制这种自噬,则可限制结肠癌细胞的增殖活性。但是,目前临床抑制细胞自噬的手段有限,需要寻找安全有效的方案。文献表明,包括自噬在内的代谢活动都受到人体自身生物钟的调控。多种生物钟基因中,调控代谢昼夜节律的Rev-erb(Reverse-erythroblastosis,反向成红细胞增多症)基因与癌细胞自噬密切相关。Rev-erb是一种自噬负调节因子,可以抑制细胞自噬。SR9009是Rev-erb的小分子激动剂,可以提高Rev-erb的表达。因此,从Rev-erb入手抑制肿瘤细胞自噬可能是一种结肠癌治疗策略。本文采用HCT116人结肠癌细胞系作为研究对象,加入Rev-erb激动剂SR9009,使用倒置相差显微镜观察细胞的增殖情况;使用CCK-8试剂盒检测细胞活性,选择SR9009的适宜浓度与作用时间;Real-time PCR检测Rev-erbα、Rev-erbβ以及自噬基因Beclin1、LC3、p62的转录变化;Western blot检测Rev-erbα、Rev-erbβ、Beclin1、LC3和p62的蛋白表达变化。结果发现与对照组相比,Rev-erb激动剂SR9009显著抑制HCT116细胞的增殖,SR9009的有效作用浓度为20μmol/L,作用时间为24 h。SR9009显著提高HCT116细胞Rev-erbα和Rev-erbβ的表达,并降低了HCT116细胞自噬基因Beclin1和LC3的表达,引起自噬底物p62累积。在SR9009处理基础上,用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬,HCT116细胞活性降低;用雷帕霉素(rapamycin)提高自噬,HCT116细胞活性回升。综上所述,小分子激动剂SR9009可以激活生物钟基因Rev-erb的表达,并通过其降低细胞自噬,达到抑制结肠癌细胞增殖的目的。这为探索结肠癌治疗的时间生物学方案提供了一定的理论依据。第一章Rev-erb激动剂SR9009抑制HCT116细胞增殖及迁移研究目的:探讨Rev-erb激动剂SR9009对HCT116结肠癌细胞的增殖、迁移、活性的改变效果。研究方法:(1)显微镜观察:培养HCT116结肠癌细胞,向培养液中加入Rev-erb激动剂SR9009,使用倒置相差显微镜观察细胞的增殖情况。(2)CCK-8法:CCK-8试剂盒检测细胞活性,选择SR9009适宜处理浓度与作用时间。(3)Real-time PCR:SR9009处理HCT116细胞后,检测Rev-erbα、Rev-erbβ的转录变化。(4)Western blot:SR9009处理HCT116细胞后,检测Rev-erbα、Rev-erbβ的蛋白表达变化。研究结果:(1)SR9009抑制HCT116细胞的增殖及迁移:与对照组相比,Rev-erb激动剂SR9009显著抑制HCT116细胞的增殖。(2)SR9009抑制HCT116细胞增殖的剂量和作用时长:SR9009的有效作用浓度为20μmol/L,作用时间为24 h。(3)SR9009提高HCT116细胞的Rev-erb表达:SR9009处理HCT116细胞后,经过Real-time PCR和Western blot检测,HCT116细胞Rev-erbα和Rev-erbβ的表达显著提高。结论:Rev-erb激动剂SR9009抑制HCT116细胞增殖及迁移。第二章SR9009降低HCT116细胞自噬研究目的:探讨Rev-erb激动剂SR9009对HCT116结肠癌细胞的自噬基因的改变效果。研究方法:(1)Real-time PCR:SR9009处理HCT116细胞后,检测Beclin1、LC3、p62转录变化。(2)Western blot:SR9009处理HCT116细胞后,检测Beclin1、LC3、p62的蛋白表达变化。研究结果:(1)SR9009降低HCT116细胞自噬相关基因Beclin1和LC3的转录。(2)SR9009降低HCT116细胞Beclin1和LC3的表达,自噬底物P62增加。结论:SR9009降低HCT116细胞自噬。第三章SR9009通过降低自噬抑制HCT116细胞增殖活性研究目的:探讨Rev-erb激动剂SR9009是否通过调控自噬达到对HCT116结肠癌细胞增殖的抑制。研究方法:(1)自噬工具药:3-MA抑制自噬,rapamycin促进自噬。(2)CCK-8法:CCK-8试剂盒检测细胞活性,选择SR9009适宜处理浓度与作用时间。研究结果:(1)3-MA促进SR9009对HCT116细胞活性的抑制。(2)rapamycin逆转SR9009对HCT116细胞活性的抑制。结论:SR9009通过降低自噬对HCT116结肠癌细胞增殖的抑制。