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目的:在脑缺血性损伤过程中血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏是脑缺血促发脑水肿和脑梗死的重要病理改变,也是脑缺血后病理生理改变的重要环节及影响药物治疗效果的关键因素之一。因此本研究用线栓法复制大鼠脑缺血/再灌注损伤(MCAO/R)的病理模型,研究在前期实验中对脑缺血性损伤具有明显保护作用的天麻Et OAc提取物及其酚性成分C的作用是否与保护BBB有关,并探讨其可能的作用机制。方法:1.复制大鼠MCAO/R模型将体重在250-300g的SPF级、雄性SD大鼠,用10%水合氯醛(0.3m L/100g体重)腹腔注射麻醉,线栓法复制大鼠MCAO/R模型,实验动物手术缺血2h,再灌注24h,对模型大鼠进行神经病学评分、检测脑组织EB含量、透射电镜观察BBB超微结构的变化,以判断大鼠造模是否成功。2.天麻Et OAc提取物和酚性成分C对血脑屏障保护作用的研究线栓法复制大鼠MCAO/R模型,各组动物于脑缺血2h再灌注24h,对模型大鼠进行神经病学评分、检测脑组织含水量和脑组织EB含量,以评价天麻Et OAc提取物对BBB的保护作用;对模型大鼠进行神经病学评分、检测脑组织EB含量,以评价天麻酚性成分C对BBB的保护作用。3.天麻Et OAc提取物和酚性成分C对血脑屏障保护作用的机制研究3.1缺血侧脑组织NO、NOS表达的测定:线栓法复制大鼠MCAO/R模型,各组动物于脑缺血2h再灌注24h,硝酸还原酶法检测模型大鼠缺血侧脑组织NO的含量,酶联免疫法检测模型大鼠缺血侧脑组织中e NOS、n NOS、i NOS的活性,评价天麻Et OAc提取物和酚性成分C对大鼠MCAO/R模型NO过量生成的影响,并明确其对NOS通路的影响,探讨其保护BBB的可能机制。3.2血脑屏障相关蛋白表达的测定:线栓法复制大鼠MCAO/R模型,各组动物于脑缺血2h再灌注24h,Western-Blot法检测模型大鼠缺血侧脑组织AQP-4,TJ相关蛋白(Occludin、Claudin-5),MMPs(MMP-2、MMP-3、MMP-9)的蛋白表达水平的变化,评价天麻Et OAc提取物和酚性成分C对大鼠MCAO/R模型AQP-4表达上调、TJ蛋白(Occludin、Claudin-5)缺失以及MMPs表达上调的影响,探讨其保护BBB的可能机制。结果:1.大鼠MCAO/R模型的复制与评价该法复制的模型大鼠有明显的神经功能缺失症状,缺血侧脑组织有明显的EB渗出现象,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.001);且透射电镜的结果也表明,模型组大鼠BBB的结构有不同程度的损伤和改变,表明大鼠MCAO/R模型复制成功,可用于BBB保护作用及机制的研究。2.天麻Et OAc提取物和酚性成分C对血脑屏障的保护作用2.1天麻Et OAc提取物对血脑屏障的保护作用:与模型组比较,天麻Et OAc提取物高(105.27mg/kg)、低(11.397mg/kg)剂量组均能明显降低模型大鼠缺血侧脑组织的EB含量(P<0.01);且天麻Et OAc提取物高(105.27mg/kg)剂量组还能明显改善模型大鼠的神经病学缺失症状(P<0.01)、明显降低模型大鼠缺血侧脑组织的含水量(P<0.05),表明天麻Et OAc提取物对BBB有一定的保护作用。2.2天麻酚性成分C对血脑屏障的保护作用:与模型组比较,天麻酚性成分C高(20mg/kg)、低(10mg/kg)剂量均能明显改善模型大鼠的神经病学缺失症状(P<0.01),且均能明显降低模型大鼠缺血侧脑组织的EB含量(P<0.001和P<0.01),表明天麻酚性成分C对BBB有一定的保护作用。3.天麻Et OAc提取物和酚性成分C对血脑屏障保护作用的机制3.1天麻Et OAc提取物对血脑屏障保护作用的机制:3.1.1天麻Et OAc提取物对大鼠MCAO/R模型NO含量及NOS活性的影响:与模型组比较,天麻Et OAc提取物高(105.27mg/kg)、低(11.397mg/kg)剂量组能明显降低模型大鼠缺血侧脑组织NO(P<0.001和P<0.01)含量,n NOS(P<0.01和P<0.05)、i NOS(P<0.05)的活性;对e NOS的活性没有明显影响。3.1.2天麻Et OAc提取物对大鼠MCAO/R模型BBB相关蛋白表达的影响:与模型组比较,天麻Et OAc提取物高(105.27mg/kg)、低(11.397mg/kg)剂量组均能明显减少模型大鼠缺血侧脑组织Occludin的缺失,差异有统计学意义(P<0.05);天麻Et OAc提取物高剂量(105.27mg/kg)组还能明显下调模型大鼠缺血侧脑组织AQP-4表达、以及减少模型大鼠缺血侧脑组织Claudin-5的缺失,差异有统计学意义(P<0.05及P<0.01);而对MMP-2、MMP-3及MMP-9的表达有下调的趋势,但差异无统计学意义。3.2天麻酚性成分C对血脑屏障保护作用的机制:3.2.1天麻酚性成分C对大鼠MCAO/R模型NO含量及NOS活性的影响:与模型组比较,天麻酚性成分C高(20mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组能明显降低模型大鼠缺血侧脑组织NO(P<0.05和P<0.001)含量,n NOS(P<0.01和P<0.001)、i NOS(P<0.01和P<0.01)的活性,对e NOS的表达没有明显影响。3.2.2天麻酚性成分C对大鼠MCAO/R模型BBB相关蛋白表达的影响:与模型组比较,天麻酚性成分C高(20mg/kg)、低(10mg/kg)剂量组均能明显下调模型大鼠缺血侧脑组织AQP-4的表达,差异有统计学意义(P<0.01及P<0.001);能明显减少模型大鼠缺血侧脑组织Occludin的缺失,差异有统计学意义(P<0.05);天麻酚性成分C高剂量组还能明显减少模型大鼠缺血侧脑组织Claudin-5的缺失,差异有统计学意义(P<0.01);而对MMP-2、MMP-3及MMP-9的表达有下调的趋势,但差异无统计学意义。结论:1.天麻Et OAc提取物和酚性成分C能降低脑缺血过程中BBB的通透性,对BBB有一定的保护作用。2.天麻Et OAc提取物和酚性成分C对BBB保护作用的机制与其降低脑组织NO的含量、i NOS、n NOS的活性、下调AQP-4的高表达以及减少TJ相关蛋白(Occludin、Claudin-5)的缺失有关。