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背景：肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinoma RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。其发病率在泌尿系统中仅次于膀胱癌,。肾癌对放疗及化疗均不敏感,手术切除仍是目前最佳的治疗手段,但术后复发率约为20%-40%。由于肾癌的化疗及放疗抵抗性,临床上没有有效的术后治疗手段。目前的研究仍然对肾癌的发生以及进展的机制缺乏足够深入的理解。探索肾癌的发生发展分子机制,寻找有效的诊断、预后分子标志物及分子治疗靶点,具有重要的意义。miRNA是一类长度约为20-24个核苷酸的由内源基因编码的非编码RNA单链分子。越来越多的研究证明这些普遍存在的非编码小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。miRNA的表达水平具有分化的时序性和位相性。对于各类疾病,尤其是肿瘤而言,miRNA也出现了时间和空间上的表达异常,本研究希望在肾癌中寻找可能的异常表达,并发现其在基因调控中所扮演的作用。目的：在收集的肾癌患者手术切除的标本组织中采用荧光定量PCR的方法检测miR-335-5p的表达情况,分析影响miRNA表达水平的表观遗传机制。以获得性功能实验观察miR-335-5p在肾癌细胞系786-O, ACHN和Caki-1中的生物学功能。并且根据生物信息学知识,对潜在的miR-335-5p作用靶点进行验证,并通过靶点分子的沉默和过表达实验,证实miR-335-5p对靶点的调控意义,探索可能存在的分子调控机制。方法：1.在25对配对的肾癌组织标本检测miR-335-5p的相对表达量,统计分析miR-335-5p在肾癌及癌旁肾脏组织中的表达差异,并分析不同病例级别与分期的肾癌中miR-335-5p的表达情况；2.通过体外转染miR-335-5p模拟体(mimic)的方式来进行获得性功能实验。通过CCK-8、平板克隆形成、Transwell小室法和流式细胞周期检测等手段来分析上调miR-335-5p的表达对细胞增殖及迁移侵袭能力带来的影响；3.结合在线生物信息学工具对miR-335-5p进行靶基因预测,然后利用Real Time PCR, Western Blot等验证靶基因mRNA以及蛋白表达量的变化,并利用荧光素酶双报告系统对miR-335-5p的靶序列进行鉴定,并使用RNA干扰、质粒过表达拯救实验等进一步证实靶向调控关系。结果：1.在收集的25例肾癌组织标本中,有19例为miR-335-5p相对低表达,占76%。癌组织中]miR-335-5p表达量平均约为癌旁组织的1/10。2.肾癌细胞系786-0,ACHN和Caki-1及22例肾癌组织中miR-335-5p启动子区CpG岛较癌旁正常组织呈现高度甲基化状态,提示DNA甲基化可能与miR-335-5p在肾癌中的低表达有关。3.体外转染miR-335-5p mimic至肾癌786-0, ACHN和Caki-1细胞株从而过表达miR-335-5p,可以抑制其生长。并且其抑制率呈现时间与浓度依赖性,在50nMmiR-335-5p mimic处理72小时后,其抑制率可达到30-40%(p<0.05)。流式细胞周期检测发现50nM miR-335-5p mimic作用48小时后可以诱导三种肾癌细胞发生G1期阻滞,而流式细胞凋亡检测提示miR-335-5p过表达并不能诱导细胞凋亡。miR-335-5p过表达可以抑制肾癌细胞体外克隆形成能力。Transwell小室实验提示miR-335-5p过表达不能抑制肾癌细胞的侵袭和迁移能力。4.成功构建裸鼠的皮下荷Caki肿瘤模型。瘤内给予脂质体包裹的miR-335-5p,观察到移植瘤的生长受到明显抑制,同时检测到瘤组织中增殖相关蛋白Ki67和p-Rb表达下调。5.通过在线软件的分析,将序列比对程序分析结果与细胞表型变化相结合,预测CDK2、CCNE2可能是miR-335-5p的靶基因,同时通过Real-time RT-PCR和Western Blot实验检测到CDK2和CCNE2在过表达miR-335-5p后mRNA水平和蛋白水平都有下调。进一步荧光素酶报告系统分析证实CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶点,其3’-UTR中存在miR-335-5p调控的作用序列。6.miR-335-5p对肾癌细胞的抑制增殖作用部分通过AKT/FOXO1信号通路实现。结论：1.与癌旁对照组织相比,肾癌组织中miR-335-5p相对表达量显著下调。但是本研究未能提示miR-335-5p表达量高低与肾癌的恶性程度相关。2.体外转染miR-335-5p mimic使其过表达使得肾癌细胞株发生细胞周期阻滞及增殖抑制。同时,miR-335-5p的过表达还削弱了肾癌细胞的克隆形成能力。3.CDK2和CCNE2是miR-335-5p的直接作用靶点,还可以通过/AKT/FOXO1信号通路发挥抑制增殖作用。