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禽流感(Avian influenza, AI)是由A型流感病毒感染家禽引起的多种症状的综合征。基于血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种主要表面标志性抗原,流感病毒被分为16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1～N9)。H9N2亚型禽流感是低致病性禽流感主要亚型之一,在世界范围内广泛存在,呈地方流行性、危害持久、难以控制等特征。禽流感的快速正确诊断及确定亚型,对控制禽流感疫情及预防禽流感向人类传播具有重要意义。虽然各国对禽流感防治策略不尽相同,但都把禽流感的快速诊断及监测作为首要步骤。本研究利用两株针对H9-HA特异性单抗H9-HA-1C3和H9-HA-2G4,建立了胶体金免疫层析和双夹心ELISA检测禽流感H9亚型的特异性快速检测方法,并进行了初步应用。1双抗体夹心ELISA检测禽流感H9亚型方法的建立本研究利用实验室研制的多株抗H9亚型禽流感特异性单克隆抗体,通过HRP标记配对组合实验,初步建立了以单抗H9-HA-1C3作为捕捉抗体,H9-HA-2G4作为检测抗体的双抗体夹心ELISA检测H9亚型禽流感的方法。对工作浓度等条件进行优化,结果证明捕捉抗体的最佳包被浓度为1.25μg/mL,二抗的最适工作浓度为0.25-tg/mL。该方法特异性好,与禽流感H5亚型、新城疫、传染性支气管炎等病毒均无交叉反应；与病毒的HA效价相比,该方法的灵敏度可达1/4个血凝单位。2禽流感H9亚型快速检测试纸条的制备利用柠檬酸三钠还原法制备了粒径30nm的胶体金溶液,采用双抗体夹心的原理制备H9-HA胶体金试纸条。即将金标抗体H9-HA-2G4喷于金标垫上；将兔抗鼠IgG和单抗H9-HA-1C3分别固定于NC膜的C线和T线,当检测样品中含有H9亚型AIV时,C、T线均显色,而不含有H9亚型AIV的只C线显色。本试纸条只与H9亚型禽流感特异性反应,与其他试验病毒如禽流感H5亚型、新城疫、传染性支气管炎等病毒无交叉反应,灵敏度达到1/4个血凝单位。且批内、批间重复性良好,在4℃真空条件下保存6个月,其特异性、灵敏性均无明显变化。3不同方法快速检测禽流感H9亚型的效果比较将本研究建立的上述两种检测方法分别与经典检测方法即病毒分离相比较。结果发现,对于组织样本,H9ELISA与病毒分离阳性符合率为80%,阴性符合率100%；H9试纸条与病毒分离阳性符合率为70%,阴性符合率100%。对于活禽交易市场采集的棉拭样本189份,H9试纸条和H9ELISA检测与病毒分离的符合率为97.9%。两种H9亚型禽流感检测方法特异性良好,在群体检测时,效果好,均无假阴性出现,具有很好的应用前景。