论文部分内容阅读
CCCTC-结合因子(CTCF)是一个多功能的转录因子,广泛表达于真核生物的体细胞中。CTCF序列高度保守,中部312个氨基酸残基形成11个连续的锌指结构,这些锌指结构以不同的组合形式结合至不同的DNA靶位点,并募集多种蛋白,行使诸多功能,包括启动子激活与抑制、基因沉默与绝缘、基因印记、X染色体失活、细胞生长分化调控和肿瘤发生等。CTCF这一系列功能的行使,都需要通过核孔复合体进入细胞核,但迄今为止国内外没有CTCF跨核膜递送机制的相关报道。文献报道及实验室前期研究表明,CTCF在细胞内的分布可能与其表达水平相关,而不同的分布形式可能影响肿瘤细胞的侵袭能力。为了证实该推测,本论文进行了以下内容的研究:一、CTCF的细胞内的分布与其表达水平相关在低侵袭性的肝癌细胞SMMC-7721、HepG2细胞和宫颈癌细胞HeLa细胞中,CTCF主要定位于细胞核内。选择CTCF的2个RNA干涉靶点,以荧光素酶的干涉靶点为对照,制备siRNA转染细胞。一方面利用免疫印迹检测CTCF表达水平的变化,一方面利用免疫荧光染色检测CTCF在细胞内定位的改变。结果表明2个靶点都可以成功地敲降CTCF的表达;CTCF表达水平下调后,其在细胞核内的分布比例明显降低,而在细胞质的分布比例明显增加,CTCF主要定位于细胞质中。推测敲降转录因子CTCF的表达水平下调了某一个或几个与大分子跨核膜递送相关的基因的表达,进而抑制了CTCF的入核递送。二、CTCF调控IPO13的表达在寻找转录因子CTCF调控的靶基因时,本实验室采用CHIP-on-chip检测到输入蛋白13(IPO13)的基因启动子区有CTCF的结合。IPO13属于转运受体超家族—Karyopherins家族,该家族蛋白负责几乎所有大分子的跨核膜转运过程。IPO13可介导转录激活因子NF-Y、myopodin、hUBC9、RBM8(Y14)-MGN、糖皮质激素受体等蛋白的入核递送以及eIF-1A的出核递送。推测IPO13可介导CTCF的跨核膜递送。为排除假阳性结果,对芯片数据进行了验证,利用CHIP-PCR证实在SMMC-7721、MDA-MB-453、HepG2和HeLa细胞中,CTCF可结合于ipo13启动子区,结合位点位于-774至-573bp之间。进一步证实CTCF可以调控IPO13的表达:在MDA-MB-157细胞中过表达CTCF,RT-PCR检测ipo13的转录本明显增多,免疫印迹检测IPO13的表达量也明显增加,说明过表达CTCF可以在RNA水平和蛋白水平上调IPO13的表达;在HepG2、SMMC-7721和HeLa细胞中敲降CTCF的表达,免疫印迹检测IPO13的表达水平明显降低,说明敲降CTCF会下调IPO13的表达。三、IPO13介导CTCF的跨核膜递送推测IPO13可介导CTCF的跨核膜递送,而大分子的跨核膜转运需要运输受体与底物分子形成多聚复合物,进而由运输受体介导底物入核,因此,CTCF与IPO13之间应当存在蛋白质相互作用。利用大肠杆菌表达GST及GST-IPO13融合蛋白,利用麦芽胚体外翻译系统表达CTCF,在不引入任何其它真核蛋白的情况下进行GST pull-down实验,证实CTCF与IPO13在体外存在直接的相互作用。此外,还利用HepG2细胞裂解液进行Co-IP实验,证实CTCF与IPO13在生理条件下也存在蛋白质相互作用。进一步利用免疫荧光染色检测IPO13对CTCF细胞内定位的影响:在MDA-MB-231和MDA-MB-157细胞中过表达IPO13后,CTCF在细胞核内的分布比例明显增多,而细胞质中的分布比例相应减少,说明IPO13的表达上调会促进CTCF的跨核膜递送;而在HepG2、SMMC-7721和HeLa细胞敲降IPO13后,CTCF在细胞核内的分布比例明显减少,在细胞质的分布比例相应增加,表明IPO13的表达下调会抑制CTCF的跨核膜递送。此外,还在HeLa和SMMC-7721细胞中进行了拯救实验,即敲降CTCF表达的同时过表达IPO13,证实CTCF的表达水平影响的CTCF的细胞内定位可由IPO13代偿。第二、三部分的结果揭示了一种CTCF跨核膜转运的机制,即CTCF调控IPO13的表达,而IPO13介导CTCF的跨核膜递送,也就是一种CTCF自身调控的跨核膜转运机制。四、CTCF对肿瘤细胞侵袭性的影响在本部分中,针对CTCF对肿瘤细胞侵袭性的影响进行了初步的探讨。改变CTCF的表达水平或改变IPO13的表达水平进而改变CTCF在细胞内的定位,然后进行Transwell侵袭实验,分析肿瘤细胞侵袭能力的变化。在低侵袭性的肝癌细胞HepG2和SMMC-7721细胞中下调CTCF的表达,Transwell侵袭实验结果证实肿瘤细胞的侵袭能力明显增强,说明CTCF表达水平的下调会提高肿瘤细胞的侵袭能力。同样在这两株细胞中敲降IPO13的表达,Transwell的结果表明肿瘤细胞的侵袭能力增强,说明当CTCF在细胞质内的分布比例增多时,肿瘤细胞的侵袭能力增强。而在高侵袭性的乳腺癌细胞MDA-MB-157中过表达IPO13,Transwell检测到肿瘤细胞的迁移及侵袭能力降低,表明当CTCF在细胞核内的分布比例增多时,肿瘤细胞的侵袭能力降低。总结:本研究揭示了CTCF的表达水平、细胞内定位、肿瘤细胞侵袭性三者之间的联系,即CTCF通过自身表达水平的变化调控IPO13的表达,而IPO13介导CTCF的跨核膜递送,使得CTCF表达水平的变化影响CTCF在细胞内的分布,CTCF不同的分布形式进而影响肿瘤细胞的侵袭能力。