艾滋病即获得性免疫缺陷综合征,已发展成全球性流行病,给人类健康带来了灾难性危害。高效抗逆转录病毒治疗(HAART)疗法的广泛使用,使得HIV-1感染者的艾滋病发病率和病死率均显著下降。然而,HIV在药物选择压力下会发生适应性变异,耐药突变毒株导致的抗病毒治疗失败越来越多,耐药毒株的产生及在人群中传播,影响抗病毒治疗效果,使得顺利实施治疗预防新发感染策略存在挑战。目前常规的耐药检测方法即In-house方法具有操作繁琐、周期长、检出率低等不足,严重影响了HIV耐药人群的检测效率。开展对抗病毒治疗压力下HIV耐药位点突变的快速检测手段迫在眉睫。随着测序技术的快速发展,下一代测序技术具有信息量大、灵敏度高、快速准确等优点,已广泛用于病毒的检测和变异的研究中。然而,目前临床单位十分缺乏基于NGS技术进行HIV-1耐药突变基因检测的技术方法和应用性的诊断试剂盒。基于此,本论文开展了基于Ion Torrent PGM测序平台对HIV-1蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶区(INT)耐药突变基因的检测方法建立和应用的研究。首先,我们针对HIV-1 PR与RT区共43个主要耐药突变位点,设计了26对引物,分为两个引物池进行多重PCR扩增。基于Ion Torrent PGM测序平台进行测序,测序结果表明该方法可以覆盖PR/RT区43个主要耐药突变位点,覆盖率达100%;选取HIV-1、HBV、HCV、KSHV和HSV阳性血液样本,经多重PCR扩增结果显示仅HIV-1样本有目的条带检出,该结果表明此方法具有较好的特异性;另外,除主要流行的HIV-1 B、C、CRF 01＿AE、CRF 07＿BC和CRF 08＿BC外,该检测方法还可以对近期发现的CRF 64＿BC、CRF 78＿cpx、CRF 85＿BC、CRF86＿BC、CRF 96＿cpx、CRF 100＿01C和URF重组型样本进行有效扩增,表明该方法具有广泛的适用性;选择1000 copies/m L的临床样本进行梯度稀释确定该方法的灵敏性,结果显示该方法可检出62.5 copies/m L的低病毒载量样本;重复性评价结果发现该方法三次重复的CV值均<5%。以上结果表明成功建立了基于NGS技术对HIV-1 PR与RT区耐药突变基因的检测方法。其次,我们针对HIV-1 INT区共10个耐药突变位点设计了16对引物,分为两个引物池进行多重PCR扩增。基于Ion Torrent PGM测序平台进行测序,测序结果分析表明该方法可以覆盖INT区的10个耐药突变位点,覆盖率达100%;同HIV-1 PR与RT区耐药突变基因检测方法中的特异性、适用性、灵敏性与重复性验证实验,进行HIV-1 INT区耐药突变基因检测方法的验证。结果表明成功建立了基于NGS技术对HIV-1 INT区耐药突变基因的检测方法。最后,分别随机选择经HAART治疗的临床样本20例进行HIV-1 PR与RT区耐药突变基因检测方法的初步应用,临床样本15例进行HIV-1 INT区耐药突变基因检测方法的初步应用,以检测和评价建立的方法是否可用。统计突变频率≥5%的数据,结果发现,PR区检测出M46I(100)、F53L(21)、I54T(5)、V82F(30)共4个突变位点;RT区检测出D67E(10)、D67G(11)、K70R(33)、L74I(9)、V82L(5)、V82F(5)、Y115F(6)、M184V(31)、L101E(14)、P225(43)共8个突变位点的10种耐药突变;INT区检测出G118R(23)、Y143H(10)共两个突变位点,而Sanger测序未检测到这些突变位点。另外,此方法还检测出<5%的低频率突变,说明我们建立的测序方法检出率高,并且有数据支撑更具有说服性。综上,本文建立了基于NGS技术对HIV-1 PR/RT区和INT区耐药突变基因的检测方法,该方法经评价具有准确度好、适用性广、特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,为HIV-1患者治疗过程中耐药突变基因的检测提供了重要的技术手段。