为了解决每年全国爆发的大量水华蓝藻打捞后难以消化以及由此造成的二次污染问题,同时克服处置蓝藻低附加值、被动消化的缺点,一种从蓝藻体内提取纯化高纯度藻胆蛋白的方法应运而生。本文以巢湖新鲜蓝藻为实验原料,以Cellufine A-500与羟基磷灰石为柱色谱填料,通过柱色谱法精致纯化藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白,并运用单因素试验与响应面法优化柱色谱运行条件;通过紫外-可见吸收光谱法分段研究两种填料柱色谱法精致纯化藻胆蛋白洗脱峰的光谱学特征及其变化规律,能够定性定量地判断出各洗脱峰的组分和含量变化;结合两种填料的特性,能够分析出藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白等的电荷特性与配位能力强弱,从而揭示两种柱色谱填料分段洗脱的内在机理和本质。在Cellufine A-500纯化藻蓝蛋白实验中,通过对洗脱液pH、离子强度、洗脱速度、进样浓度等单因素实验与响应面法优化,得出最优条件为:洗脱液pH为7.29、离子强度为0.23 mol/L、洗脱速度为5.95 mL/min、进样浓度为1 mg/mL。此时藻蓝蛋白纯度最高为4.42、试剂级藻蓝蛋白回收率为60.32%。在羟基磷灰石纯化藻蓝蛋白实验中,通过对洗脱液pH、缓冲液浓度、洗脱速度、进样浓度等单因素实验与响应面法优化,得出最优条件为:洗脱液pH为6.32、磷酸盐缓冲液浓度为0.08 mol/L、洗脱速度为3.56 mL/min、进样浓度为2 mg/mL。此时藻蓝蛋白纯度最高为4.51、试剂级藻蓝蛋白回收率为38.36%;别藻蓝蛋白纯度最高为4.48、试剂级别藻蓝蛋白回收率为10.35%。在Cellufine A-500纯化藻胆蛋白过程中,随着洗脱液的更换,洗脱曲线上会出现4个洗脱峰,经扫描取样点的紫外-可见吸收光谱后发现:I峰主要成分为带正电荷或电中性的杂蛋白与类胡萝卜素;II峰主要成分为带少量负电荷的藻红蛋白、杂蛋白与核酸;III峰主要成分为带有较多负电荷的高纯度藻蓝蛋白及少量别藻蓝蛋白,且由于藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白未能完全分离,制约了藻蓝蛋白纯度的进一步提高;IV峰主要成分为带有大量负电荷的杂蛋白与低纯度藻蓝蛋白。在羟基磷灰石纯化藻胆蛋白过程中,随着洗脱液的更换,洗脱曲线上会出现3个洗脱峰,经扫描取样点的紫外-可见吸收光谱后发现:I峰主要成分为阳离子或碱性蛋白质的杂蛋白、核酸与类胡萝卜素等;II峰主要成分为与钙离子结合生成较弱配位键的高纯度藻蓝蛋白,且由于藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白能完全分离,有利于藻蓝蛋白纯度的进一步提升;III峰主要成分为与钙离子结合生成较强配位键的高纯度别藻蓝蛋白。运用紫外-可见吸收光谱综合分析两种填料的纯化效果:Cellufine A-500填料能够有效地将藻红蛋白、核酸、类胡萝卜素与杂蛋白从藻胆蛋白初步纯化液中去除,最终获得试剂级藻蓝蛋白,但不能完全分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白;羟基磷灰石填料不仅能够有效地将藻红蛋白、核酸、类胡萝卜素与杂蛋白从藻胆蛋白初步纯化液中去除,还能够有效分离藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白,同时获得试剂级藻蓝蛋白和试剂级别藻蓝蛋白。