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研究目的:过度炎症引发关节囊纤维化导致创伤后关节挛缩（Post-traumatic joint contracture,PTJC）。已经有大量研究表明,转化生长因子（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）通过调节成纤维细胞功能在PTJC中发挥关键作用,然而,关于特定细胞因子诱导TGF-β1表达促进关节囊纤维化的研究还很少。巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）是一种广泛分布的多功能促炎细胞因子,参与炎症和纤维化相关的病理生理学,已经有研究发现其在心肌梗死、房颤、囊性纤维化等慢性炎性疾病中表达增加,促进成纤维细胞增殖和纤维化相关因子尤其是TGF-β1产生,但是目前关于MIF是否能在PTJC中调节TGF-β1表达促进关节囊纤维化及其作用机制还有待进一步阐明。因此本文通过观察大鼠膝关节PTJC后MIF、TGF-β1等纤维化因子表达水平,同时使用MIF和TGF-β1重组蛋白干预原代培养的关节囊成纤维细胞,探讨MIF对大鼠PTJC中纤维化反应的影响及作用机制。研究方法:研究一:6周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只,分笼饲养,每笼2只,适应性喂养一周后,制备大鼠右膝关节PTJC模型。造模成功后,向大鼠右膝关节腔中注射不同液体:载体溶液或MIF特异性抑制剂4-碘-6-苯基嘧啶（4-Iodo-6-phenylpyrimidine,4-IPP）,将大鼠随机等分为Control组（n=30）和4-IPP组（n=30）。随后,又依据不同制动时长:0、1、3、7、14天,将每组大鼠进一步随机等分为5个小组（n=6）。各制动时间结束后,过量麻醉处死大鼠,分离大鼠右膝关节附近肌肉、肌腱、筋膜等软组织,测量Control组大鼠右膝关节被动伸展活动度（Range of motion,ROM）变化;取大鼠右膝关节后方关节囊,Western Blot方法检测后方关节囊组织MIF、TGF-β1蛋白表达情况;苏木精-伊红（Hematoxylineosin,HE）染色方法检测后方关节囊组织淋巴细胞等炎性细胞浸润情况;Masson染色方法检测后方关节囊组织胶原纤维增生情况;免疫荧光染色方法检测后方关节囊组织MIF、TGF-β1与成纤维细胞定位情况,及半定量分析MIF、TGF-β1表达情况。研究二:4周龄雄性SD大鼠10只,提取原代关节囊成纤维细胞传代2-4代,离体实验主要分为四部分:第一部分分别使用2μg/m L MIF重组蛋白、50μM MIF特异性抑制剂4-IPP、2μg/m L MIF重组蛋白联合50μM MIF特异性抑制剂4-IPP处理关节囊成纤维细胞24h,探究MIF对关节囊成纤维细胞TGF-β1表达可能产生的影响,及加入4-IPP后是否阻断了MIF的作用;第二部分使用靶向MIF高亲和力受体CD74的si RNA转染关节囊成纤维细胞48h,更换培养液后,加入2μg/m L MIF重组蛋白继续干预24h,探究MIF调节关节囊成纤维细胞TGF-β1表达是否依赖于CD74膜受体;第三部分使用2μg/m L MIF重组蛋白干预关节囊成纤维细胞0、15、30、60、120min,观察丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路亚级联信号传导途径蛋白:细胞外信号调节激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）、P38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）蛋白磷酸化水平,另外分别用10μM ERK、P38、JNK特异性抑制剂PD98059、SB203580、SP600125预处理关节囊成纤维细胞1h,更换培养基,加入2μg/m L MIF重组蛋白继续干预24h,观察ERK、P38、JNK特异性抑制剂是否阻断了MIF的作用,探究MIF调节关节囊成纤维细胞TGF-β1表达是否通过激活MAPK信号通路来实现;第四部分使用10ng/m L TGF-β1重组蛋白处理关节囊成纤维细胞24h,通过检测已知纤维化标志物α-SMA、COLⅠ等蛋白表达水平对TGF-β1促纤维化作用进行体外验证。离体实验分组,第一部分:（1）Control组;（2）MIF组;（3）4-IPP组;（4）MIF+4-IPP组。第二部分:（1）Control组;（2）si RNA组。第三部分:（1）Control组;（2）MIF组;（3）ERK抑制剂组;（4）P38抑制剂组;（5）JNK抑制剂组。第四部分:（1）Control组;（2）TGF-β1组。研究结果:研究一:1、与创伤后制动第0天相比,Control组创伤后制动第3、7、14天大鼠右膝关节被动伸展ROM显著下降（P＜0.05）。2、与创伤后制动第0天相比,Control组创伤后制动第14天大鼠右膝关节后方关节囊淋巴细胞浸润程度显著增加（P＜0.01）、胶原纤维显著增生（P＜0.01）。3、与创伤后制动第0天相比,Control组创伤后制动第1、3、7、14天大鼠右膝关节后方关节囊MIF、TGF-β1蛋白表达显著增加（P＜0.05）,MIF蛋白表达在创伤后制动第3天达到峰值（P＜0.01）。4、与创伤后制动第0天相比,Control组创伤后制动第3天MIF与关节囊成纤维细胞共定位,免疫荧光强度显著增强（P＜0.05）,第14天TGF-β1与关节囊成纤维细胞共定位,免疫荧光强度显著增强（P＜0.05）。5、与Control组创伤后制动第0天相比,Control组创伤后制动第3天MIF免疫荧光强度显著增强（P＜0.05）,后方关节囊淋巴细胞浸润程度显著增加（P＜0.05）、胶原纤维显著增生（P＜0.05）;与Control组创伤后制动第3天相比,4-IPP组创伤后制动第3天MIF免疫荧光强度显著减弱（P＜0.05）,后方关节囊淋巴细胞浸润程度显著降低（P＜0.05）、胶原纤维增生程度显著下降（P＜0.05）。6、与Control组相比,4-IPP组创伤后制动各时间点,大鼠右膝关节后方关节囊TGF-β1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。研究二:1、与Control组相比,4-IPP组关节囊成纤维细胞TGF-β1 m RNA、蛋白表达无显著变化（P＞0.05）,MIF组TGF-β1 m RNA、蛋白表达显著增加（P＜0.05）;与MIF组相比,MIF+4-IPP组TGF-β1 m RNA、蛋白表达显著减少（P＜0.05）。2、与Control组相比,si RNA组关节囊成纤维细胞CD74、TGF-β1蛋白表达显著减少（P＜0.05）。3、与MIF重组蛋白干预关节囊成纤维细胞0min相比,第15、30、60、120min,关节囊成纤维细胞ERK、P38蛋白磷酸化水平均显著升高（P＜0.05）,第15、30min,JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P＜0.05）。4、与Control组相比,si RNA组关节囊成纤维细胞ERK、P38、JNK蛋白磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）。5、与Control组相比,MIF组TGF-β1蛋白表达显著增加（P＜0.05）;与MIF组相比,ERK抑制剂组、P38抑制剂组TGF-β1蛋白表达显著减少（P＜0.05）,JNK抑制剂组TGF-β1蛋白表达水平无显著变化（P＞0.05）。6、与Control组相比,TGF-β1组纤维化标志物α-SMA、COLⅠ蛋白表达均显著增加（P＜0.05）。研究结论:1、大鼠膝关节PTJC模型中MIF、TGF-β1表达增加。2、MIF可能通过与关节囊成纤维细胞CD74膜受体相结合,激活MAPK信号通路中的ERK、P38亚级联信号传导途径,促进关节囊成纤维细胞TGF-β1表达,从而促进纤维化标志物α-SMA、COLⅠ表达增加,促进关节囊纤维化,调控PTJC中的纤维化反应。