论文部分内容阅读
C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)参与人体炎症反应,是临床诊断中的重要检测指标。家蚕杆状病毒表达系统有高效表达和翻译后修饰的功能,可规模化生产,是外源重组蛋白理想的表达系统,本研究尝试利用该系统表达重组人CRP蛋白。通过设计特异引物,以人的肝组织c DNA为模板,扩增CRP目的基因,连接到p ColdTMII载体上,构建了重组p ColdTMII-CRP表达载体,转化至E.coli BL21(DE3)中,诱导工程菌获得包涵体蛋白,经包涵体溶解,Ni-NTA柱纯化,复性得到原核表达的重组人CRP蛋白,经过SDS-PAGE,Western Blot鉴定,以及质谱分析可以确定蛋白成功表达。以原核表达的重组人CRP为抗原,免疫新西兰大耳兔,首次以弗氏完全佐剂免疫,一周后以弗氏不完全佐剂加强免疫,每周一次连续免疫四周,最后一次免疫前ELISA检测抗血清效价,达到目的效价一周后颈动脉取兔全血,离心得抗CRP血清,ELISA检测抗体效价在抗原浓度10μg/m L时抗血清效价达到1:64000。得到CRP多克隆抗体,Western Blot检测得到目的条带,可用于后续的研究中。PCR得到CRP目的基因,酶切连接到p Fast BacTMHTB转移载体,得到重组p Fast BacTMHTB-CRP转移载体,利用Bac-to-Bac系统转化到E.coli Bm DH10Bac中,筛选出重组Bacmind-CRP。转染Bm N细胞,5 d左右细胞发病,得到重组杆状病毒v Bm His-CRP。扩增病毒接种到家蚕Bm N细胞中,并穿刺接种五龄的家蚕幼虫,在家蚕Bm N细胞和五龄的家蚕幼虫中均检测到目的蛋白。为获得廉价的重组产物,故选择在家蚕体内表达,SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白,发现重组人CRP蛋白在沉淀中,引入信号肽的重组病毒同样表达包涵体,因此按照纯化大肠杆菌包涵体的办法纯化家蚕体内的重组人CRP蛋白,得到目的蛋白,表达产量略低且有少许杂蛋白。用自制的CRP多克隆抗体Western Blot检测得到目的条带,质谱检测确定该蛋白为重组人CRP蛋白。这为家蚕生物反应器规模化制备重组人CRP蛋白打下了基础,解决了临床CRP相关炎症反应快速诊断试剂盒中标准抗原的来源问题。