药材鳖甲(Trionycis Carapax)是传统动物类中药,其基原为鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的背甲,应用历史悠久。该传统中药收载于历版《中国药典》,具有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结的功效;主治阴虚发热、骨蒸劳热、阴虚阳亢、头晕目眩、虚风内动、手足瘛疭等症。基于鳖甲的功效主治,科学实验研究表明,鳖甲提取物具有显著抗肝纤维化的药效作用。现代药理学认为,肝纤维化疾患的形成是由于肝脏受损后,机体在修复过程中肝纤维组织过度沉积的可逆性病理现象,进一步发展可导致各种慢性肝病,是肝硬化和肝癌的病理学基础。在中医药理论指导下,以鳖甲为君药组方研制的鳖甲抗纤方、鳖甲软肝片、鳖甲煎丸等中成药制剂,广泛用于临床治疗肝纤维化疾病,疗效显著,受到广大患者赞誉。为了探讨鳖甲抗肝纤维化什么物质有效和为什么有效,本学位论文在前期研究基础上通过中药化学、分析化学、药理学、分子生物学等多学科交叉的研究方法,采用现代科学技术对鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础进行了较系统研究。采用超声水提法从醋鳖甲粗粉提取多肽类物质,通过膜透析法将鳖甲多肽分离为分子量大于6000 Da和小于6000 Da两大类肽类物质部位,以对肝星状细胞(HSC-T6)增殖的抑制率为检测指标,对鳖甲抗肝纤维化的活性多肽部位进行了筛选研究。研究结果表明,分子量小于6000 Da的肽为鳖甲抗肝纤维化有效肽部位。在确定鳖甲抗肝纤维化有效部位的基础上,进一步通过膜透析法将分子量小于6000有效肽部位分离为分子量0-3000 Da和3000-6000Da两个肽段,将两个肽段对肝星状细胞的抑制率进行了比较研究。研究结果表明,两个肽段均能有效抑制肝星状细胞中TGF-β1的转化力,从而减轻肝纤维化。其中,分子量0-3000 Da肽段抗肝纤维化的药效作用更优。本论文构建了肝纤维化小鼠动物模型,对鳖甲分子量0-3000 Da和3000-6000 Da有效肽段进行了抗肝纤维化的药效学研究。研究结果表明,肉眼观察肝脏外观,给药鳖甲有效肽段组小鼠与模型组小鼠比较,前者小鼠肝纤维化程度明显低于后者;比较给药组小鼠与模型组小鼠的脏器系数测定结果,给药组小鼠的心脏、肝脏、肾脏等脏器系数显著减小(P<0.05);通过HE和Masson染色观察,给药鳖甲有效肽组小鼠的肝纤维化程度明显改善。给药鳖甲有效肽组与阳性药物(愈肝龙和秋水仙碱)组动物比较,两者治疗肝纤维化的药效作用相近似。因此,表明鳖甲有效肽抗肝纤维化的药效作用显著。采用分子生物学的技术和方法,对鳖甲抗肝纤维化有效肽类物质进行了作用机理研究。采用ELISA法,检测了给药肝纤维化模型小鼠肝组织匀浆上清液中的COLⅣ、HPCⅢ、LN、HA、TNF-α、TGF-β1、IL-1β、IL-6等因子的表达,表明鳖甲有效肽能显著抑制上述因子的含量(P<0.05);采用免疫组化染色法,检测了给药肝纤维化模型小鼠肝组织中CTGF、EGFR、MMP9、p-AKT、p-p38、α-SMA、TGF-β1等因子的表达,表明鳖甲有效肽能显著下调CTGF、EGFR、p-AKT、p-p38、α-SMA、TGF-β1等因子的表达,上调MMP9的表达(P<0.05);采用蛋白免疫印迹法,检测了给药模型小鼠肝组织中p-JNK、p-ERK1/2、Smad7、p-p38、TIMP-1、MMP-1、p-Smad2等因子的表达,鳖甲有效肽能显著下调p-JNK、p-ERK1/2、p-p38、TIMP-1、p-Smad2的表达(P<0.05),上调Smad7和MMP-1的表达(P<0.05),表明鳖甲有效肽通过参与调控MAPK、Smads、TIMPs/MMPs的信号通路的途径,达到治疗肝纤维的药效作用。以上实验研究结果阐释了鳖甲有效肽类物质抗肝纤维化的作用机理。采用高效液相和串联飞行时间质谱仪[Triple TOF5600 MS],对鳖甲抗肝纤维化有效肽类物质(0-6 KD)中的两个肽段0-3 KD和3-6 KD的化学结构组成进行了分析鉴定。分析鉴定结果表明,两个有效肽段分别鉴定出评分20分以上800多个氨基酸序列,其中0-3 KD肽段中评分40分以上有18个氨基酸序列,3-6 KD肽段评分40分以上有7个氨基酸序列。上述研究结果探讨了鳖甲抗肝纤维化活性肽的结构组成,这对进一步诠释了鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础具有重要意义,并为后期化学合成抗肝纤维化肽类药物奠定了一定基础。本学位论文通过学科交叉的研究方法,较深入探讨了鳖甲抗肝纤维化的什么物质有效和为什么有效,进一步诠释了其药效物质基础,从而为鳖甲及其复方制剂用于治疗肝纤维化疾患的临床疗效提供了现代科学依据,并为该传统中药及其复方制剂开发为抗肝纤维化创新药物奠定良好基础,同时可望为合成抗肝纤维化的肽类新药提供目标化合物。