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MicroRNA（miRNA）是真核生物体内一段长度约为22nt的短链非编码RNA，通过结合靶向基因的3’端非编码区抑制靶向mRNA的翻译，从而达到调控基因表达的作用。研究表明，miRNA在不同物种间均参与细胞增殖、分化、凋亡、生长发育等不同生物学过程。肉用牛脂肪细胞增殖分化、脂肪沉积是影响生长发育和牛肉品质的重要因素，也是现代肉牛育种和生产中密切关注的技术重点和难点。因此建立牛脂肪细胞体外培养体系、建立前体脂肪细胞分化诱导体系、解析脂肪细胞增殖分化的分子调控机制可为了解肉牛脂肪沉积规律、筛查候选基因和遗传修饰元件用于肉牛分子辅助育种提供技术依据。
本研究以肉用牛为研究对象，采集犊牛皮下脂肪组织，利用酶联合消化法分离、纯化获得牛原代前体脂肪细胞，经成脂分化诱导11天后分化为终末成熟脂肪细胞。分别提取牛前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞总RNA，构建小RNA测序文库，进行BGISEQ-500测序和生物信息学分析，以筛查牛前体脂肪细胞和终末成熟脂肪细胞差异表达miRNA及调控网络分析。进而对前体脂肪细胞特异高表达的miR-199a-3p和终末成熟脂肪细胞miR-23b-3p进行功能验证分析，以鉴定其在前体脂肪细胞增殖和成脂分化相关通路中的作用，获得研究结果表明：
1、使用酶联合消化法分离、纯化获得牛前体脂肪细胞，显微镜下观察细胞呈多边形，生长活力良好。成脂分化诱导9天后，细胞核周可明显观察到大小不一的圆形脂滴增多、汇集。经油红O染色、甘油三酯测定、免疫荧光染色及qPCR等方法分析鉴定，分离、纯化的牛前体脂肪细胞在优化后的诱导体系下可顺利分化为成熟终末脂肪细胞。
2、牛前体脂肪细胞与诱导分化后的终末脂肪细胞分组构建小RNA测序文库进行了miroRNA组学测序，测序clean reads与牛sRNA数据库比对分析。前体脂肪细胞组（bos-PAD）miRNA占比约77%左右，成熟脂肪细胞组（bos-AD）miRNA占比约87%。其中bos-PAD组三组生物学重复样本，分别鉴定出497、491和524个known miRNA，预测到353、320和199个novel miRNA；bos-AD组三组生物学重复样本，分别鉴定出519、522和504个known miRNA，预测到264、246和291个novel miRNA。
3、对牛前体脂肪细胞和分化终末脂肪细胞差异表达micRNA（DEGseq）筛查分析，获得250个差异表达miRNA（fold change＞2,Q value≤0.001）。其中119个差异表达miRNA在牛前体脂肪细胞中呈不同程度高表达水平；131个miRNA在终末成熟脂肪细胞中表达上调趋势。同时，获得部分与脂肪细胞增殖、分化相关的miRNA家族，包括bta-miR-199a家族,bta-miR-378家族，bta-miR-33a，bta-miR-100等。对差异表达miRNA靶基因进行预测，获得13,480个靶基因。靶基因GO富集显示靶基因在65个GO terms显著富集（p＜0.05），包括20个分子功能GO terms，26个生物过程GO terms，19个细胞成分GO terms。靶基因KEGG通路分析结果表明，共富集到344个KEGG信号通路中，其中99个信号通路显著富集（p＜0.05）。
4、通过qPCR的方法对miR-193a-3p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b、miR-33a、miR-29b、miR-379、miR-148a、miR-449a、miR-149-5p、miR-24-3p和miR-23b-3p11个miRNA在牛前体脂肪细胞和终末成熟脂肪细胞的表达谱进行了验证，结果表明，miR-193a-3p、miR-199a-3p、miR-199a-5p等表达水平与其对应的miRNA组学测序结果完全一致。
5、构建miR-23b-3p和miR-199a-3p miRNA mimics和inhibitor及相应的negative control转染牛前体脂肪细胞。EdU细胞增殖染色结果显示，相比于对照组，转染miR-23b-3p mimics后被EdU标记的细胞数量更多；相反，转染miR-23b-3p inhibitor后被EdU标记的数量更少。结果表明miR-23b-3p可以促进前体脂肪细胞增殖。qPCR结果显示，相比于对照组，转染miR-199a-3p mimics后成脂分化相关基因表达上调；相反，转染miR-199a-3p inhibitor后成脂分化相关基因表达下调。结果表明miR-199a-3p可以促进前体脂肪细胞分化。
综上所述，本文通过分离培养牛前体脂肪细胞，并诱导分化为终末成熟脂肪细胞，通过高通量测序技术分析了前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞的miRNA表达谱，筛查到miR-23b-3p和miR-199a-3p等多个与脂肪细胞增殖及分化相关miRNA并对其调控作用进行了初步研究，为筛查牛前体脂肪细胞增殖和脂肪细胞分化关键基因、调控元件，解析其在通路中的调控作用及分子机理提供了技术依据。
本研究以肉用牛为研究对象，采集犊牛皮下脂肪组织，利用酶联合消化法分离、纯化获得牛原代前体脂肪细胞，经成脂分化诱导11天后分化为终末成熟脂肪细胞。分别提取牛前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞总RNA，构建小RNA测序文库，进行BGISEQ-500测序和生物信息学分析，以筛查牛前体脂肪细胞和终末成熟脂肪细胞差异表达miRNA及调控网络分析。进而对前体脂肪细胞特异高表达的miR-199a-3p和终末成熟脂肪细胞miR-23b-3p进行功能验证分析，以鉴定其在前体脂肪细胞增殖和成脂分化相关通路中的作用，获得研究结果表明：
1、使用酶联合消化法分离、纯化获得牛前体脂肪细胞，显微镜下观察细胞呈多边形，生长活力良好。成脂分化诱导9天后，细胞核周可明显观察到大小不一的圆形脂滴增多、汇集。经油红O染色、甘油三酯测定、免疫荧光染色及qPCR等方法分析鉴定，分离、纯化的牛前体脂肪细胞在优化后的诱导体系下可顺利分化为成熟终末脂肪细胞。
2、牛前体脂肪细胞与诱导分化后的终末脂肪细胞分组构建小RNA测序文库进行了miroRNA组学测序，测序clean reads与牛sRNA数据库比对分析。前体脂肪细胞组（bos-PAD）miRNA占比约77%左右，成熟脂肪细胞组（bos-AD）miRNA占比约87%。其中bos-PAD组三组生物学重复样本，分别鉴定出497、491和524个known miRNA，预测到353、320和199个novel miRNA；bos-AD组三组生物学重复样本，分别鉴定出519、522和504个known miRNA，预测到264、246和291个novel miRNA。
3、对牛前体脂肪细胞和分化终末脂肪细胞差异表达micRNA（DEGseq）筛查分析，获得250个差异表达miRNA（fold change＞2,Q value≤0.001）。其中119个差异表达miRNA在牛前体脂肪细胞中呈不同程度高表达水平；131个miRNA在终末成熟脂肪细胞中表达上调趋势。同时，获得部分与脂肪细胞增殖、分化相关的miRNA家族，包括bta-miR-199a家族,bta-miR-378家族，bta-miR-33a，bta-miR-100等。对差异表达miRNA靶基因进行预测，获得13,480个靶基因。靶基因GO富集显示靶基因在65个GO terms显著富集（p＜0.05），包括20个分子功能GO terms，26个生物过程GO terms，19个细胞成分GO terms。靶基因KEGG通路分析结果表明，共富集到344个KEGG信号通路中，其中99个信号通路显著富集（p＜0.05）。
4、通过qPCR的方法对miR-193a-3p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b、miR-33a、miR-29b、miR-379、miR-148a、miR-449a、miR-149-5p、miR-24-3p和miR-23b-3p11个miRNA在牛前体脂肪细胞和终末成熟脂肪细胞的表达谱进行了验证，结果表明，miR-193a-3p、miR-199a-3p、miR-199a-5p等表达水平与其对应的miRNA组学测序结果完全一致。
5、构建miR-23b-3p和miR-199a-3p miRNA mimics和inhibitor及相应的negative control转染牛前体脂肪细胞。EdU细胞增殖染色结果显示，相比于对照组，转染miR-23b-3p mimics后被EdU标记的细胞数量更多；相反，转染miR-23b-3p inhibitor后被EdU标记的数量更少。结果表明miR-23b-3p可以促进前体脂肪细胞增殖。qPCR结果显示，相比于对照组，转染miR-199a-3p mimics后成脂分化相关基因表达上调；相反，转染miR-199a-3p inhibitor后成脂分化相关基因表达下调。结果表明miR-199a-3p可以促进前体脂肪细胞分化。
综上所述，本文通过分离培养牛前体脂肪细胞，并诱导分化为终末成熟脂肪细胞，通过高通量测序技术分析了前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞的miRNA表达谱，筛查到miR-23b-3p和miR-199a-3p等多个与脂肪细胞增殖及分化相关miRNA并对其调控作用进行了初步研究，为筛查牛前体脂肪细胞增殖和脂肪细胞分化关键基因、调控元件，解析其在通路中的调控作用及分子机理提供了技术依据。