目的 本实验旨在探讨人骨髓MSCs(hMSCs)的分离、纯化、体外扩增以及向软骨细胞分化的条件。使用特定的诱导培养基对骨髓间充质干细胞进行诱导培养，用半定量RT-PCR的方法检测其是否表达Ⅱ型胶原，探讨骨髓间充质干细胞在体外向软骨细胞分化的可能性，为MSCs应用于软骨组织工程，修复损伤的软骨组织提供理论依据和技术支持。 方法 无菌条件下临床采集无血液系统疾病和家族遗传史的28-65岁成人骨髓8例，用含1O％FBS的DMEM培养液5倍稀释，2000rpm离心5min，弃上清及脂肪层，加入5ml含10％FBS的DMEM培养液，制成细胞悬液。将其接种于间充质干细胞培养液(低糖DMEM，含10％FBS，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素)中，置于37℃、5％C0<,2>饱和湿度的孵箱内培养。3天后更换培养液，小心弃去未贴壁细胞。以后每3天换液一次。待细胞长至铺满瓶底80％时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代，再以(6-8)×10<3>/cm<2>的密度接种传代培养：去除培养液，PBS冲洗1次，用0.25％的胰蛋白酶置37℃、5％C0<,2>饱和湿度的孵箱内消化3-5分钟，见细胞松动浮起时，FBS终止消化，1500rpm离心5分钟，弃上清，加入含10％FBS的DMEM培养液，调整细胞浓度，接种于25cm<2>培养瓶中，3ml/瓶，置于37℃、5％C0<,2>和饱和湿度的孵箱内培养，每3天换液1次。取第取扩增至第3代的hMSCs以5×10<4>/ml的密度接种于预先放置有消毒处理好的盖玻片的6孔板内。细胞贴壁后更换培养液。实验分2组。实验组每孔加入2ml无血清低糖DMEM培养液，内含2mg/L胰岛素、3mg/L转铁蛋白、1mmo1/L丙酮酸、100nmo1/L地塞米松和10μg/LTGF-β<,1>。对照组每孔加入2ml低糖DMEM基础培养液。每组加3孔。细胞在37℃、5％C0<,2>和饱和湿度的孵箱内培养，每3-4天换液1次。分别在诱导后的7天、14天取出玻片，进行细胞形态学、组织化学分析，与及MSCs诱导分化的软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的检测。 结果 原代培养时细胞接种24小时后即有少量圆形细胞贴壁，48小时后贴壁细胞增多。72小时后已出现数个细胞集落，每个集落约由几个到几十个细胞组成，此时培养液中仍有许多悬浮细胞。经过2-3次换液后，悬浮细胞多已被去除，贴壁变形的细胞增多，有的细胞已伸长形成长梭形或多角形，呈成纤维样细胞形态，胞浆内有细胞小颗粒，核大、圆形或椭圆形。培养瓶中的细胞集落逐渐增多，增大，12-14天时集落逐渐相互融合。传代培养后细胞的生长速度明显加快，经历24-48小时后的缓滞期后迅速进入对数生长期，10-15天铺满瓶底。诱导7天及14天后骨髓MSCs蕃红花-O染色阳性，而对照组细胞染色阴性。表明经诱导后的骨髓MSCs有粘多糖的分泌。经半定量RT-PCR检测，诱导7天和14天的骨髓MSCs表达COL2A1 mRNA，对照组未见表达。表明经诱导后的骨髓MSCs有软骨细胞特异性Ⅱ型胶原mRNA表达。 结论 (1)采用直接贴壁培养法成功分离和培养出骨髓间充质干细胞，该法可成为分离骨髓MSCs的常规方法。 (2)本实验在单层培养条件下，成功将人骨髓MSCs诱导分化成软骨细胞。经诱导培养后形成的软骨细胞具有软骨细胞的形态特征，并能分泌软骨细胞的细胞外基质成分粘多糖和特异性Ⅱ型胶原。