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端粒酶逆转录酶基因(TERT)编码的蛋白是组成端粒酶的三个主要成分之一,是端粒酶活性的限速单位。端粒酶通过在端粒末端补充“TTAGGG”重复序列阻止细胞复制性衰老。本研究检测了鸭TERT(dTERT),相对端粒酶活性(RTA)和相对端粒长度(RTL)在鸭早期发育阶段的时空分布特点。克隆了鸭TERT 5’-侧翼序列,研究了表观遗传特别是DNA甲基化对dTERT表达的调控作用。最后,基于双荧光素酶活性检测和生物信息学分析,选择靠近转录起始位点的近端调控区作为靶序列,利用CRISPR-Cas9技术内源性激活了鸭小肠上皮细胞中的TERT。结果如下:1.鸭TERTmRNA,相对端粒酶活性(RTA)和相对端粒长度(RTL)的时空分布特点在出生后7天雏鸭的所有8个测试组织(心脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠、腿肌、性腺和胰腺)中均检测到了TERTmRNA的表达。其中,TERT在小肠和肾脏中的表达水平最高,其次依次是心脏、腿肌、脾脏、胰腺,在性腺和肝脏中的表达水平最低。在肝脏发育过程中,dTERT的表达趋势先从E13(胚胎期13天)到E19增加,然后从E19到E26急剧下降,并在D7(出生后7天)达到最低水平。而在腿肌中,dTERT的表达水平从E13到E19变化不大,从E19到E26显著增加,从E26到D7明显减少。在所有测试的雏鸭(D7)组织中均检测到了相对端粒酶活性(RTA),其中小肠中的端粒酶活性特别高,肾脏、心脏和胰腺中的端粒酶活性相对较低,端粒酶活性表现最低的是肝脏和腿肌。随着胚胎的发育,肝脏和腿肌中的RTA水平均显著下降。此外,雏鸭(D7)腿肌中的相对端粒长度(RTL)最长,其次是肾脏、小肠、肝脏、心脏和胰腺。从胚胎发育到出生阶段,肝脏中的RTL从E13到E26相对稳定,到D7时明显缩短。在腿肌中,RTL从E13到E26有小幅度的增加,而到D7时也显著缩短。2.鸭TERT 5’-侧翼序列的克隆及DNA甲基化调控研究克隆获得了2,413bp长的dTERT 5’-侧翼序列,并提交给GenBank(GenBank No.MH910094)。5’-RACE将转录起始位点定位到了-93bp处,定义为新的转录起始位点(+1)。生物信息学分析显示,鸭TERT5’调控区有三个CpG岛(S1,S2和S3)。亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)结果表明,与小肠(D7)或肝脏(E19)相比,dTERTmRNA表达量显著较低的肝脏(D7)在S1区具有更高的甲基化水平。荧光定量PCR结果显示,DNA甲基转移酶DNMT1表达水平在肝脏(D7)中显著高于其他两个组织。体外细胞实验表明,经过甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine(5-aza-dC)处理后,鸭胚成纤维细胞(DEFs)和小肠上皮细胞(DIECs)中dTERT表达均显著增加,同时S1区的甲基化水平显著降低,上述实验进一步证明了dTERT受到DNA甲基化的表观遗传调控。此外,用组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatinA(TSA)处理DEFs和DIECs后,也导致dTERT表达显著增加,提示组蛋白乙酰化也可能参与鸭TERT的转录调控。3.利用CRISPR-Cas9技术内源性激活鸭TERT双荧光素酶实验表明转录起始位点(+1)上游541bp是鸭TERT的核心启动子区,结合潜在转录因子位点的生物信息学分析,将-370/-150作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶序列。用慢病毒法将10种Cas9-sgRNAs混合质粒转染DIECs后继续培养细胞,当培养到编辑后第5代时(CRISPR 5P)鸭TERT的表达有轻微上调。随着传代的进行,dTERT转录逐渐增强,直到在CRISPR13P时维持一个稳定的水平。当未编辑的DIECs进入衰老停滞时,CRISPR编辑的DIECs依然具有良好的细胞形态和增殖活性。Sanger测序显示,CRISPR 5P DIECs中所有sgRNAs都成功整合进鸭基因组,靶区域呈现出不同形式的基因突变。当培养到编辑后18代时,存活的CRISPR 18PDIECs中的优势突变是靶序列上74bp的缺失,而优势sgRNAs是sgRNAs2,sgRNAs7和sgRNAs9。检测RTA和RTL发现,CRIPSR编辑的DIECs中RTA被成功激活,但是并没有阻止端粒的缩短。荧光定量TERT潜在的靶基因表明,dTERT可能以一种端粒非依赖方式通过抑制衰老凋亡相关基因来维持细胞生长。最后,用LPS和poly(I:C)处理表明,CRISPR编辑的TERT被成功激活的鸭小肠上皮细胞依然具有正常的免疫反应功能。