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目的:动脉粥样硬化(artherosclerosis,AS)是心血管系统疾病中最常见的疾病。AS主要累及大中动脉,可致管壁变硬,管腔狭窄,并引起一系列继发性病变。血管内皮损伤和功能障碍与动脉硬化的发生发展关系密切,它是动脉粥样硬化的始动环节,是多种心血管疾病产生和恶化的基础。近年研究显示,氧化应激在血管病变,尤其是AS过程中扮演着重要角色。葡萄籽原花青素(grapeSeedproeyanidin,GPC)是从葡萄籽中提取出来的一类多酚化合物,它具有极强的抗氧化等活性。本实验通过过氧化氢损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡建立血管内皮氧化损伤模型,加以原花青素的干预。检测原花青素能否抑制过氧化氢引起的细胞氧化损伤、细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的表达变化。这可为开发干预内皮细胞氧化应激反应的抗AS新药提供一条新思路,为临床的应用提供实验依据。 方法:体外培养内皮细胞,将细胞分为6组,即空白对照组(Control)、氧化损伤组(H2O2)、氧化损伤加入维生素C对照组(VitC+H2O2)、氧化损伤加入原花青素(5μmol/L、25μmol/L,50μmol/L)浓度组(Proanthocyanidins-L+H2O2、Proanthocyanidins-M+H2O2、Proanthocyanidins-H+H2O2)。将750μmol/LH2O2作用于加入维生素C及不同浓度原花青素预培养24小时的内皮细胞,继续培养18小时(半胱氨酸蛋白酶表达测定时间为14小时),以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色试验,AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡,乳酸脱氢酶(LDH)活性,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量为检测指标,并用 Western blot法检测Caspase-3蛋白表达。 结果:1.MTT的结果显示:过氧化氢明显地减弱了血管内皮细胞的增殖活性,而在加入低、中、高浓度的原花青素干预后均可明显地增强血管内皮细胞增殖活性。 2. AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡显示:过氧化氢明显地增加血管内皮细胞的凋亡率,原花青素可以有效抑制过氧化氢引起的内皮细胞的凋亡。 3.乳酸脱氢酶(LDH)活性,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量检测显示:750μmol/L过氧化氢明显增加LDH水平、MDA量,降低NO含量,与正常组相比均有统计学意义(p<0.01),而在加入5μmol/L、25μmol/L,50μmol/L浓度原花青素干预后,LDH水平、MDA量活性明显降低,与损伤组相比均有统计学意义(p<0.01),加入5μmol/L浓度原花青素干预后,NO含量升高与损伤组相比无统计意义(p>0.05),而加入25μmol/L,50μmol/L浓度原花青素干预后,NO含量明显升高,与损伤组相比有显著差异(p<0.01)。 4. Western blot结果显示:过氧化氢刺激血管内皮细胞18h后,其Caspase-3蛋白的表达明显升高,与正常组相比均有统计学意义(p<0.01)。而在5μmol/L、25μmol/L,50μmol/L浓度的原花青素干预过氧化氢处理组后其Caspase-3蛋白的表达明显降低,与H2O2组比较均有统计学意义(p<0.01)。 结论:本研究表明,原花青素通过减轻内皮细胞的脂质过氧化损伤,保护内皮细胞膜的完整性,促进 NO释放以减轻过氧化氢诱导的血管内皮细胞的损伤。H2O2通过调节激活线粒体凋亡通路上Caspase-3表达导致人血管内皮细胞凋亡。而原花青素干预后可抑制Caspase-3表达,引起血管内皮细胞的凋亡率下降,对血管内皮具有保护作用。