论文部分内容阅读
弗氏链霉菌是泰乐菌素的产生菌,它严格好氧,其发酵液由于较粘稠而导致溶氧较差,因此溶氧成为泰乐菌素产量提高的限制性因素之一.该研究旨在通过在弗氏链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因(vhb)来改善氧的传递,进而改善菌体生长,提高泰乐菌素的产量.pIJ8600是能整合于链霉菌染色体的表达载体,其含有链霉菌噬菌体oC31整合性位点,并拥有能被硫链丝菌素诱导的强启动子(P<,tipA>).将vhb基因置于P<,tipA>之下,构建成vhb基因表达载体pWQ2005,通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移导入弗氏链霉菌中,PCR验证表明vhb基因成功整合到染色体上,经硫链丝菌素诱导后,CO结合差光谱分析显示,pWQ2005表达出有生物活性的VHb蛋白.摇瓶发酵实验初步证实,VHb蛋白的表达可明显促进泰乐菌素的合成与菌体的生长,但不同诱导时间产生的作用效果差异显著.pSET152与pIJ8600属同一类型的载体,但其不含用以表达外源基因的启动子;该研究利用其构建成含自身启动子的vhb基因表达载体pWQ1116,但vhb基因在限氧条件下却未在弗氏链霉菌中表达,这可能是弗氏链霉菌的RNA聚合酶不能识别该启动子.红霉素抗性基因启动子(P<,ermE>)是能在链霉菌中组成型表达的强启动子.应用SOE-PCR(Splicing of Overlap Extension by PCr)将不含自身启动子的vhb基因置于P<,ermE>之下,利用P<,ermE>表达vhb基因.为使vhb基因在弗氏链霉菌中更好的表达,对其进行了定点诱变,构建成经诱变的vhb基因表达载体pWQ2004和pWQ1023,并构建成未诱变的vhb基因表达载体pWQ1118作对照;CO结合差光谱分析显示,三者在弗氏链霉菌中均表达出有生物活性的透明颤菌血红蛋白(VHb),但与对照相比,经诱变的vhb基因表达量有所提高.候选接合子(Streptomyces fradiae/p WQ2004)经初筛后,进行的摇瓶与5L罐发酵结果初步显示,VHb蛋白的表达显著促进泰乐菌素合成与菌体的生长,这种作用越是在限氧条件下,表现的越是明显.