研究背景蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)是一种严重威胁人类健康的神经外科急危重症,约占全部脑卒中的5%-10%,其中85%的出血原因为颅内动脉瘤破裂。尽管诊断方法、血管介入、手术夹闭、以及围手术期处理等临床手段较前取得了巨大的进步,大大降低了动脉瘤破裂再出血的发生率,但SAH的致死率和致残率未获得明显降低,其对社会经济造成的负担巨大。过去四十年来,脑血管痉挛一直被认为是导致高死亡和高致残的主要因素,可惜,针对脑血管痉挛的治疗临床上并未获得成功。近期越来越多的证据提示：脑血管痉挛可能只是SAH的病理因素之一,甚至可能仅仅只是SAH后期的临床表现。事实上,多种脑损伤机制共同参与了SAH的病理生理过程,包括早期脑损伤(Early brain injury,EBI),皮层去极化和微循环障碍等。它们相互作用,共同导致了SAH灾难性的结局。其中,国际卒中学术界已经逐渐接受了EBI是SAH致死致残的主要原因。新概念EBI指从SAH后72小时以内发生的一系列脑损伤。目前,对EBI病理生理机制已有了初步的认识,主要包括动脉瘤破裂后的机械性损伤、颅内压升高、脑血流量降低、脑灌注压下降、大脑皮质的广泛去极化、细胞凋亡和坏死、自噬作用、离子稳态的破坏、炎症反应、血脑屏障破坏、及脑水肿等,但具体的损伤机制及信号通路需要进一步的探索研究。炎症反应和神经元凋亡是EBI机制研究的热点。多种炎症通路已在SAH后EBI中激活。SAH患者血液及脑脊液中的炎症因子水平与患者的损伤程度及预后密切相关。白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)是参与EBI的主要炎症因子,但其在SAH脑内准确的来源及具体的生成释放机制仍不清楚。Cryopyrin炎症小体能够识别来自病原相关分子模式或者宿主来源的危险信号分子的信号,招募促炎症蛋白酶caspase-1并致其自我激活。活化的caspase-1切割IL-1β和IL-18的前体,产生成熟IL-1β和IL-18。P2X7受体(P2X7receptor, P2X7R)是cryopyrin炎症小体的上游分子。P2X7R激活导致的K+外流是cryopyrin炎症小体激活的主要机制之一。目前,尚无P2X7R和cryopyrin炎症小体在SAH中临床和实验研究。SAH发生后,脑内广泛区域神经元发生凋亡,并导致脑损伤。动物实验已证实：减少神经元凋亡可以明显改善SAH造成的神经功能损伤。促凋亡因子和抗凋亡因子及其上游信号通路共同参与了SAH后凋亡反应的整个过程。其中,活化的caspase-3是诱导的细胞凋亡的核心,也是凋亡反应的真正执行者。抑制caspase-3的激活对治疗SAH至关重要。前期研究发现：P2X7R可以调控caspase-3的活性。因此,本课题推测阻断P2X7R的激活可以缓解SAH后神经元的凋亡,从而改善SAH后的神经功能,并探索其中相应的病理机制。SAH能够引I起全身炎症反应综合征,并发急性多器官功能障碍,表现为心脏骤停,肺、肾等脏器损伤,和胃肠反应等。神经源性肺水肿增加SAH患者的死亡率,但是,其发生具体的机制和治疗手段尚不明确。目前,全身炎症反应和肺血管压力升高是两种可能的主要机制。P2X7R在肺组织的多种细胞膜上广泛表达,并于炎症反应密切相关,因此,本课题推测P2X7R可能参与了SAH引发的神经源性肺水肿(Neurogenic pulmonary edema,NPE),目前国内外尚未开展相关研究。近年来,研究提示P2X7R参与多种中枢神经系统疾病的发展过程,作用广泛而且非常重要。本研究拟在前期工作基础上,探索P2X7R阻断剂能否减轻SAH后EBI和非神经系统并发症,其保护作用是否与抗炎,抗凋亡和缓解NPE有关。1.P2X7R/Cryopyrin炎症小体在蛛网膜下腔出血后炎症发生中的作用研究目的本部分实验检测大鼠SAH后P2X7受体,cryopyrin炎症小体的组件(cryopyrin, apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC), caspase-1前体)及下游的炎症因子的表达,包括成熟IL-1p和IL-18；了解P2X7R/cryopyrin炎症小体信号通路在SAH炎症反应中的作用,并进一步阐明炎症对SAH神经功能的影响,为探索抑制SAH炎症的破坏作用开拓新思路和提供必要的理论依据。研究方法根据不同的实验内容,该部分研究分四部分：(1)建立大鼠SAH血管内穿刺模型,观察SAH后72h内P2X7R/cryopyrin炎症小体通路随时间的变化趋势及其是否在小胶质细胞上表达。应用Western Blot方法检测P2X7R, cryopyrin分子及其下游主要的炎症因子IL-1p在SAH后2h,6h,24h,48h和72h的表达情况。应用免疫荧光技术观察P2X7R和cryopyrin炎症小体分别与小胶质细胞共定位的情况。(2)该部分实验分为sham, SAH+Vehicle(生理盐水,脑室注射),SAH+scramble small interfering RNA (siRNA), SAH+P2X7R siRNA和SAH+cryopyrin siRNA。SAH建模前24h,左侧脑室注射P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA基因敲除相应分子。采用改良Garcia评分综合平衡木试验评估大鼠SAH的神经功能,干湿重法测量脑水肿及Western Blot检测相应的下游分子水平,包括：P2X7R,cryopyrin,活化caspase-1,成熟的IL-1β和成熟的IL-18。(3)该实验分为Naive,Naive+Lipopolysaccharide(LPS),Naive+LPS+Benzoyl benzoyl ATP(BzATP), Naive+LPS+BzATP+scramble siRNA,和Naive+LPS+BzATP+cryopyrin siRNA。侧脑室注射内毒素LPS建立大鼠的中枢神经系统炎症模型。在该模型上,LPS注射前21h脑室注射scramble siRNA或cryopyrin siRNA,LPS注射后3h脑室注射P2X7R的激动剂BzATP。Western Blot检测cryopyrin,活化caspase-1,成熟的IL-1β的表达,确定大鼠脑内P2X7R和cryopyrin炎症小体之间的关系。(4)该研究内容分为sham,SAH+vehicle, SAH+brilliant blue G (BBG,5mg/kg),SAH+BBG(30mg/kg), SAH+BBG(100mg/kg)五组,选取SAH后24h和72h作为观察的时间点,采用改良的Garcia评分和平衡试验评估大鼠SAH的行为学,干湿重法测量脑水肿,Western Blot检测相应的下游分子水平改变,包括P2X7R,活化的caspase-1,成熟的IL-1β/IL-18和myeloperoxidase(MPO),免疫荧光技术检测MPO以观察SAH后中性粒细胞的浸润情况。研究结果(1)本组研究发现SAH后72h内,cryopyrin和成熟的IL-1β的表达在24h时达到高峰,而P2X7R的水平并没有明显的改变。Cryopyrin和P2X7R分别小胶质细胞的标志物为离子钙接头分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)共荧光定位,提示上述分子在小胶质细胞内表达。(2)在SAH后24h,相比vehicle和scramble siRNA, P2X7R siRNA和cryopyrin siRNA降低下游炎症分子活化caspase-1,成熟IL-1β及IL-18的表达；缓解SAH后脑水肿和改善的大鼠的神经功能评分。(3)在LPS诱导的大鼠中枢神经系统炎症模型中,P2X7R的激动剂BzATP明显增加下游炎症因子：活化caspase-1和成熟IL-1β的水平。Cryopyrin siRNA能够消除BzATP的促炎症作用。(4)中剂量BBG (30mg/kg)缓解SAH后的脑水肿,改善神经功能评分,这种神经功能保护作用可能与减少炎症因子：激活的caspase-1,成熟IL-1β/IL-18的表达有关。此外,BBG阻滞中性粒细胞向脑组织的浸润。研究结论SAH后,P2X7受体/cryopyrin炎症小体信号通路激活caspase-1/IL-1β/IL-18,导致EBI中炎症发生,该通路是调控SAH炎症反应发生的新机制,针对P2X7R/cryopyrin炎症小体信号通路为此后的SAH的治疗开拓新思路和提供必要理论依据。2.P2X7R阻断剂抑制蛛网膜下腔出血早期神经元凋亡的机制研究研究目的本课题试图阐明大鼠SAH后P2X7R在神经元凋亡中的作用,并探索该作用的具体信号机制,探索P2X7R/P38丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路在SAH后神经元凋亡中的作用,从而进一步阐明凋亡在SAH后EBI中的影响,并为探索抑制SAH后神经元凋亡开拓新的研究思路。研究方法根据不同的实验内容,该部分研究分两部分：(1)该实验分为sham, SAH+Vehicle, SAH+BBG和SAH+BBG+BzATP。SAH建模成功后30min,于腹腔给予BBG或相应等体积的Vehicle(生理盐水)。P2X7R的激动剂BzATP于SAH建模前3h脑室注射。采用改良的Garcia评分和平衡木试验分别评估SAH大鼠的行为学；干湿重法测量脑水肿及Western Blot检测相应的下游分子水平改变,包括：P2X7R,磷酸化P38MAPK蛋白,Bcl-2及成熟caspase-3蛋白。免疫荧光双染共定位P2X7R和神经元细胞核(neuronal nuclei,NeuN)用来检测该受体在神经元上的表达分布情况。Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated uridine5’-triphosphate-biotin nick end-labeling(TUNEL)染色观察SAH后神经元凋亡情况。(2)该实验分为sham,SAH+Vehicle, SAH+scramble siRNA和SAH+P2X7R siRNA。SAH建模前24h,通过脑室注射P2X7R siRNA敲除相应P2X7R,采用改良的Garcia评分和平衡木试验分别评估SAH大鼠的行为学,Western Blot检测相应的下游分子水平改变,包括P2X7R,磷酸化P38MAPK蛋白及成熟caspase-3蛋白。研究结果(1)本组研究发现SAH后24h,P2X7R在神经元的细胞膜上表达。(2)Western blot显示30mg/kg BBG明显减少SAH后24h P38MAPK磷酸化水平的表达,降低成熟caspase-3的表达水平,相反,增加抗凋亡因子Bcl-2的表达。TUNEL染色显示BBG明显减少SAH造成的神经元凋亡。(3)相比vehicle和scramble siRNA,P2X7R siRNA明显减少SAH后24h磷酸化P38MAPK的表达,降低成熟caspase-3的表达水平,改善SAH后的神经功能。研究结论P2X7R参与SAH后EBI中神经元凋亡。P2X7R抑制剂降低SAH后磷酸化P38MAPK的表达,减少成熟caspase-3的表达,最终,缓解神经元凋亡并改善大鼠神经功能。该研究阐明了P2X7R作为EBI中凋亡的新机制,为后续的SAH的抗凋亡治疗开拓新思路和提供必要理论依据。3.P2X7R阻断剂抑制蛛网膜下腔出血后神经源性肺损伤的机制研究研究目的本部分研究试图阐明大鼠SAH后P2X7R在SAH后NPE中的作用,该受体阻断剂能否通过其抗炎作用缓解NPE的症状,从而进一步阐明炎症在SAH后NPE中的作用,并为探索治疗SAH引起的NPE开拓新的研究思路。研究方法该实验分为sham,SAH+Vehicle, SAH+BBG。SAH建模成功后30min,于腹腔给予BBG (30mg/kg)或相应等体积的Vehicle(生理盐水)。观察NPE相关症状的发生率,测量大鼠的体重及肺湿重,Western Blot检测肺叶中相应的炎症分子：成熟IL-1p和MPO的改变和紧密连接蛋白：zonula occludens-1(ZO-1)和occludin。明胶酶谱检测肺组织内matrix metallopeptidase-9(MMP-9)的活性。P2X7R和I型肺泡上皮细胞(T1-α)进行免疫荧光双染。Hemotoxylin-eosin (HE)染色比较上述三组肺损伤的情况。研究结果(1)本组研究发现SAH后24h,P2X7R在Ⅰ型肺泡上皮细胞的细胞膜上表达。(2)大鼠SAH后NPE相关症状的发生率与P指数相一致。(3)BBG减少SAH后24h肺叶组织中成熟IL-1β和MPO的水平,抑制MMP-9的活化,增加紧密连接蛋白ZO-1和occludin的水平。HE染色显示BBG明显缓解SAH后肺组织损伤程度。研究结论NPE相关症状用于SAH后NPE的诊断。P2X7R抑制剂降低SAH后肺组织内炎症因子,保护肺血屏障,缓解SAH后NPE。该部分研究为SAH后NPE的诊治提供新思路和必要理论依据。