Ⅰ类整合子作为与食源微生物耐药性进化紧密相关的DNA元件,能通过位点特异性重组来捕获外源耐药基因盒并使之表达,使宿主获得新的耐药性;同时Ⅰ类整合子可借助接合性质粒、转座子等可移动基因元件实现耐药基因的水平转移,造成耐药性的快速传播和扩散,甚至由此进化出了多重耐药菌,对人类健康构成了巨大威胁。迄今为止,尚未开发出有效的策略来应对由Ⅰ类整合子引发的上述问题。基于此,本研究以广宿主接合性质粒R388上的Ⅰ类整合子为研究对象,利用CRISPR系统对其进行敲除和抑制,致力于缓解由Ⅰ类整合子造成的细菌多重耐药性;同时依据整合子具有捕获和表达基因盒的功能特点,通过CRISPR和λRed系统将Ⅰ类整合子改造为一种基因重组工具;随后使用该重组工具构建可利用柠檬酸为碳源生长的大肠杆菌（Escherichia coli）平台菌株,并联合CRISPRi系统来调控葡萄糖代谢网络中的流量分布以期大幅提高宿主菌生产乌头酸的能力。主要研究内容包括:1.在E.coli中构建了可特异性敲除R388质粒Ⅰ类整合子的CRISPR/Cas9系统,并通过对CRISPR质粒转化效率的计算、相应药物最小抑菌浓度（MIC）的测定、Ⅰ类整合子拷贝数的测定和靶位点的DNA测序等方面来评估敲除效果。结果表明,CRISPR质粒的转化造成E.coli丢失了Ⅰ类整合子携带的耐药性,转化子对甲氧苄胺嘧啶（TMP）和磺胺甲基异噁唑（SUL）的复敏率均高达99%,且CRISPR质粒的转化质量与TMP、SUL的复敏率呈负相关;在转化子中TMP和SUL的MIC变化呈多样性,这是由于CRISPR/Cas9造成的靶位点DNA断裂导致Ⅰ类整合子拷贝数出现了不同程度的减少;此外还发现有6株转化子中的CRISPR/Cas9系统发生了部分脱靶——这些菌株中有45%的整合子靶序列缺失了17 bp,推测此突变的产生是为了逃避CRISPR/Cas9系统的识别。2.在E.coli中构建了可敲低Ⅰ类整合子介导的耐药基因表达的CRISPRi系统,并通过反转录实时荧光PCR（RT-q PCR）测定耐药基因的表达、阿尔玛蓝-微量肉汤稀释（MABA）法检测相应药物的半抑制浓度（IC50）以及CRISPRi菌株的生长曲线监测来评估敲低效果。结果显示,CRISPRi系统将dfr B2（整合子可变区中耐药基因盒,编码TMP抗性）和sul1（整合子3’-保守端耐药基因,编码SUL抗性）的转录水平分别下调了36.797.4%和20.883.8%;而CRISPRi对dfr B2和sul1的转录抑制则导致了菌株对TMP和SUL的敏感性增加——TMP和SUL的IC50分别降低了87.5%和5096.875%;以上两种药物敏感性的增加使得CRISPRi菌株在含有TMP或SUL的环境中生长受限。对含有不同g RNA的CRISPRi系统进行评估,我们发现含有g RNA R3、R6的CRISPRi系统对dfr B2和sul1基因表达的敲低效果较好,且其敲低程度与诱导剂脱水四环素（a Tc）之间具有明显的剂量—效应关系。通过g RNA R3和R6的靶标位置可得出:位于int I1模板链中Pc启动子的-35区和位于int I1非模板链中Pc启动子下游31 bp处都是CRISPRi系统的理想靶标,可显著敲低Ⅰ类整合子介导的耐药基因表达。3.进一步利用构建的CRISPRi系统抑制了Ⅰ类整合子介导的耐药基因整合。通过接合转移将捕获了aad A1、aad B基因盒的整合子借助R388质粒从供体菌E.coli C600转移至受体菌E.coli J53中,根据aad A1、aad B基因的水平转移率即可反映出aad A1、aad B基因盒的整合效率。同时结合RT-q PCR对整合酶基因int I1的转录测定结果来评估CRISPRi系统对耐药基因整合的抑制效果。结果显示,CRISPRi系统将int I1的转录水平下调了7096%;而CRISPRi对int I1的转录抑制则导致了Ⅰ类整合子介导的耐药基因整合受阻——aad A1和aad B基因盒的整合效率均由10-2降低至10-310-5。对含有不同g RNA的CRISPRi系统进行评估,发现含有g RNA R3的CRISPRi对aad A1和aad B基因盒的整合抑制效果最好,且抑制作用的强弱可通过a Tc浓度改变进行控制,同时该系统具有较强的遗传稳定性。通过g RNA R3的靶标位置可得出:位于int I1非模板链中Pc启动子下游31 bp处是CRISPRi系统抑制Ⅰ类整合子捕获耐药基因的理想靶标。4.利用CRISPR/Cas9和λRed系统将R388质粒Ⅰ类整合子插入到E.coli BL21（DE3）基因组,构建了Ⅰ类整合子敲入株E.coli BINT;同时又构建了基因盒工程载体p Li-int I1-cassette,该载体在IPTG的诱导下能够产生被整合子捕获的目的基因盒。我们先以egfp作为报告基因证实了整合子重组工具在E.coli中应用的可行性,随后利用该重组工具将柠檬酸转运蛋白基因cit S整合至E.coli BINT基因组中,成功构建了可利用柠檬酸为碳源生长的平台菌株E.coli BINT-cit S,用于后续代谢工程改造来生产乌头酸。5.最后构建了靶向E.coli异柠檬酸脱氢酶（IDH,由icd A基因编码）和丙酮酸激酶（PK,由pyk A、pyk F基因编码）的CRISPRi系统,通过对IDH和PK的单独抑制及组合抑制,在细胞生长、葡萄糖消耗、靶基因表达、体外酶活和代谢水平等方面进行评估,最终筛选出了同时靶标icd A和pyk F的CRISPRi菌株可有效平衡三羧酸循环和糖酵解的速率来显著提高乌头酸产量。在摇瓶发酵和上罐发酵中,此CRISPRi菌株的乌头酸产量分别达到了对照菌株的60倍（362.80±22.05 mg/L）和15倍（623.80±20.05 mg/L）。同时该菌株的乙酸和乳酸产量也出现了大幅下降,但作为副产物之一的柠檬酸却在上罐发酵后期大量积累。为提高菌株对柠檬酸的利用率,我们将可同时抑制IDH和PK的CRISPRi系统在柠檬酸利用菌株E.coli BINT-cit S中诱导表达以进一步提高乌头酸产量。最终,在5 L体系的上罐发酵中重组菌的乌头酸产量达到了730.85±29.75 mg/L。总之,本研究利用CRISPR系统成功敲除、抑制了Ⅰ类整合子,这对靶向Ⅰ类整合子药物的研发提供了理论依据,同时也为防治食源微生物的多重耐药性开辟了新的道路;还借助CRISPR和λRed系统将整合子改造为大肠杆菌基因重组工具,并用其构建了平台工程菌株E.coli BINT-cit S,拓宽了整合子在原核生物中的开发应用;最后在E.coli BINT-cit S中利用CRISPRi系统调控了葡萄糖代谢网络中的流量分布,使乌头酸合成得到大幅提升,这为高水平生产中心代谢途经的中间产物提供了宝贵见解。