柘木黄酮类化学成分及抗肿瘤活性研究

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目的:1.文献报道柘木的黄酮类成分具有抗癌活性,因此本文对可能存在黄酮类成分的柘木药材乙醇干膏的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分进行提取、分离,并鉴定化学成分,为柘木活性成分研究提供参考。2.由于柘木总黄酮和总多糖提取工艺研究未见报道,因此本文对柘木药材中总黄酮和总多糖的提取工艺进行考察并测定含量,为柘木药材的开发利用提供科学参考;环桂木黄素体外抗肿瘤活性明显,HPLC测定不同产地柘木中环桂木黄素含量,为柘木药材的质量评价标准提供新的参考。3.由于柘木在临床治疗食道癌方面有比较好的疗效,因此本文通过对柘木药材总黄酮和总多糖的体外药理活性筛选,考察其对不同癌细胞的抗癌活性,为进一步扩大柘木药材的应用范围和探讨其抗癌机理提供参考。4.本文通过大孔树脂分离纯化柘木药材中总黄酮,研究其纯化工艺,为柘木药材的工业化生产提供科学参考材料与方法:1.材料与试剂柘木:桑科植物柘树Cudrania tricuspidata (Carr.) Bur.的干燥根及藤茎。实验材料采自广西南宁市郊外,由广西中医学院中药鉴定教研室廖月葵老师提供并鉴定,各商品药材购自广西各地和安国药材市场。2.方法(1)通过硅胶柱层析,凝胶柱层析,重结晶等分离纯化手段,从柘木干膏的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分里分离、纯化单体化合物。(2)通过单因素考察、正交试验确定柘木总黄酮和总多糖的最佳提取工艺;HPLC法测定不同产地柘木药材中环桂木黄素的含量。(3)采用MTT还原法,筛选柘木总黄酮类和总多糖类的体外抗肿瘤活性(人宫颈癌HeLa细胞、人肺腺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞、人胃癌SGC7901细胞)(4)利用静态吸附方法筛选柘木总黄酮的最适大孔树脂,利用动态吸附方法研究最适大孔树脂分离柘木总黄酮的条件。结果:1.通过对柘木黄酮类化合物的研究,从乙酸乙酯和正丁醇部分分离鉴定了7个单体化合物,分别为:①二氢桑色素、②胡萝卜苷、③5,7,4’-三羟基二氢异黄酮、④山奈酚、⑤槲皮素、⑥β-谷甾醇,⑦环桂木黄素。2.经过单因素考察、正交试验结果,柘木总黄酮的最佳提取工艺为:12倍量60%乙醇提取3次,每次1.5 h,平均浸膏得率为6.68%,平均总黄酮含量为1.92%,RSD<3%(n=3);总多糖的最佳提取工艺为:药材去色素干燥后,10倍提取溶媒,提取温度为90℃提取时间为3 h,平均总多糖含量为1.89 mg·g-1,RSD<3%(n=3);HPLC法测定不同产地柘木药材中环桂木黄素的含量,色谱条件为:色谱柱为Aglinet C18 (150×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱;流速为1 mL·min-1;柱温为25℃;检测波长为203 nm。测得广西灵山县产的柘木中环桂木黄素含量最高,为3.45 mg·g-1。3.通过MTT还原法实验发现,柘木总黄酮对癌细胞均有不同程度的抑制作用,对癌细胞的抑制作用为:HeLa细胞>A549细胞> SGC-7901细胞>HepG2细胞。柘木总多糖对癌细胞的抑制作用:SGC-7901细胞>HeLa细胞>HepG2细胞>A549细胞。4.通过静态吸附与解析实验,筛选了5种大孔树脂,确定用AB-8型大孔树脂来纯化柘木总黄酮,该树脂的最佳条件为:以1.5mL·min-1的流速上样后,用5倍量上柱树脂体积的75%乙醇的洗脱。结论:1.文献报道柘木黄酮类成分为其抗癌的活性成分,因此本文从柘木的化合物分离入手,得到了7个单体化合物,分别为:二氢桑色素、胡萝卜苷、5,7,4’-三羟基二氢异黄酮、山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇、环桂木黄素。其中二氢桑色素、5,7,4’-三羟基二氢异黄酮、山柰酚、槲皮素、环桂木黄素为黄酮类化合物。2.首次对总黄酮和总多糖的提取工艺进行考察,最佳提取工艺条件稳定可行,可为柘木开发利用提供科学参考。首次采用HPLC测量不同产地柘木药材中环桂木黄素的含量,该法操作简便、快捷、灵敏度高,可为柘木药材的质量评价提供新的指标和方法。3.通过MTT实验发现,人宫颈癌HeLa细胞、人肺腺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞、人胃癌SGC7901细胞在总黄酮和总多糖作用下与未加药物的阴性对照组相比均有不同程度的增长抑制现象,浓度越大抑制作用越强,多糖的抑制效果不如黄酮。4.本文筛选了适合柘木黄酮纯化的大孔树脂型号及纯化条件,为工业化生产得到更高纯度和活性的总黄酮提取物提供了科学参考。
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