论文部分内容阅读
研究背景:m6A甲基化是上世纪70年代被发现的RNA分子水平上的甲基化修饰方式,影响RNA稳定性、剪切、运输以及翻译活性,对细胞的生物学功能有着重要的影响。随着甲基化检测水平的不断提高以及检测方法的不断完善,RNA甲基化成为近年来的研究热点。研究证实,甲基化相关酶作为甲基化的调节因子在多种癌症的发生、发展中通过改变RNA的甲基化水平而发挥作用。本文将探索性检测RNA甲基化相关调节因子在乳腺癌中的表达情况,探讨RNA甲基化相关调节因子与乳腺癌分子分型及预后的关系,并对筛选出的LRPPRC调节因子进行生物学功能验证,为乳腺癌RNA甲基化研究提供研究依据。材料和方法:1.生物信息学分析:通过ONCOMINE数据库对23个m6A RNA甲基化相关因子进行表达差异分析,随后对从TCGA数据库获得的1096个乳腺癌样本及112个正常样本进行该甲基化相关因子表达差异分析。从GEO数据库获取47例乳腺癌与癌旁信息进行23个m6A RNA甲基化相关因子表达差异验证。随后采用R v3.5.1以及STRING、bc-GeneExminerv4.5、Kaplan-Meier Plotter 数据库进一步分析 m6ARNA 甲基化调节因子之间的相关性、在乳腺癌临床病理特征以及分子亚型间的表达差异以及m6A RNA调节因子的表达与预后相关性。2.组织芯片验证:对于生物信息分析筛选出的m6ARNA甲基化调节因子LRPPRC进行进一步的验证。通过免疫组化方法检测乳腺癌组织芯片中乳腺癌与对应癌旁样本中LRPPRC的表达水平,探究LRPPRC在乳腺癌及癌旁组织中的表达差异、与临床病理特征的相关性以及预后差异。3.体外实验:通过Western Blot以及RT-qPCR方法检测人正常乳腺上皮细胞以及乳腺癌细胞系中LRPPRC的表达水平。运用脂质体将siRNA转染至乳腺癌细胞中,干扰LRPPRC表达,用Western Blot以及RT-qPCR检测siRNA干扰效率。利用集落形成实验以及CCK-8实验检测细胞克隆与增殖情况;划痕实验与Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力;TUNEL细胞凋亡检测法检测细胞凋亡水平。结果:1.来自ONCOMINE、TCGA和GEO的数据库的分析结果显示,部分RNA甲基化调节因子在乳腺癌与正常组织中存在表达差异。2.TCGA 数据分析显示,根据 YTHDF3、ZC3H13、LRPPRC、METTL16、RBM15B表达情况构建的风险模型具有较好的预测价值,是患者总生存率（OS）的独立风险因素。Kaplan-Meier Plotter显示,乳腺癌患者中YTHDF3和LRPPRC的相对高表达以及RBM15B,ZC3H13和METTL16的相对低表达具有更高的无复发生存率（RFS）。3.bc-GenExMiner v4.5表明LRPPRC水平与ER和PR表达呈负相关,而METTL16、RBM15B、ZC3H13水平与ER和PR表达呈正相关。在HER-2阴性乳腺癌患者中,LRPPRC、METTL16、RBM15B和ZC3H13的表达均高于HER-2过表达组。LRPPRC高表达以及METTL16、RBM15B和ZC3H13低表达的患者Nottingham Prognostic Index（NPI）和 Scarff-Bloom-Richardson（SBR）等级更高。4.组织芯片免疫组化检测发现,LRPPRC在乳腺癌组织中高表达。LRPPRC蛋白的表达水平与肿瘤大小、肿瘤TNM分期、是否远处转移相关,LRPPRC高表达的患者总生存率（OS）更差。Western Blot与RT-qPCR检测结果发现,LRPPRC在乳腺癌细胞 BT474、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468 中高表达。5.siRNA可以显著抑制LRPPRC在SK-BR-3以及MDA-MB-231的表达水平,敲低LRPPRC可以抑制SK-BR-3以及MDA-MB-231的集落形成,抑制SK-BR-3增殖,抑制MDA-MB-231的迁移能力,抑制SK-BR-3以及MDA-MB-231的侵袭能力,促进SK-BR-3以及MDA-MB-231的凋亡。结论:1.生物信息分析结果提示:利用m6A RNA甲基化调节因子YTHDF3、ZC3H13、LRPPRC、METTL16和RBM15B构建的风险模型具有较好的预测价值,且在乳腺癌中的表达水平与乳腺癌分子分子分型、预后等相关。2.组织芯片结果提示:LRPPRC在乳腺癌组织样本中高表达,LRPPRC蛋白的表达水平与肿瘤大小、肿瘤TNM分期、是否远处转移相关,LRPPRC高表达的患者总生存率（OS）更差。3.体外实验结果提示:LRPPRC在乳腺癌细胞中高表达,干扰LRPPRC的表达可以抑制乳腺癌细胞的集落形成、增殖、迁移与侵袭,促进乳腺癌细胞凋亡。