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传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)是重要养殖鱼类鳜鱼(Siniperca chuami)暴发性流行病的病原,为虹彩病毒科(Iridoviridae),细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)的代表种。虎纹蛙病毒(tigerfrog virus,TFV)是使养殖虎纹蛙蝌蚪(Rana tigrina rugulosa)和中华鳖(Trionyxsinensis)发病致死的主要病原,属于虹彩病毒科,蛙病毒属(Ranavirus)。
本研究用ISKNV对本实验室现有鱼类细胞系进行了敏感细胞系筛查,结果没有找到可感染ISKNV的细胞系。基于此,开展了鳜鱼多种组织及仔鱼的原代细胞培养工作。其中鳜鱼心脏和脑的原代细胞在传代至9代左右时无法继续维持;鳍条细胞(MF)可传代至13代,无法继续培养;肾细胞(MK)生长情况良好,可传代培养至13代左右;鳜鱼仔鱼细胞(M-Fry)在传至30余代后仍保持良好状态,存活一年多,营养条件及培养环境基本稳定,有望建立成熟细胞系。通过ISKNV攻毒实验,发现M-Fry、MK和MF在感染ISKNV后均可以出现细胞病理变化(cytopathognic effect,CPE),但并非典型的病毒空斑现象。逆转录PCR结果证实该病毒确实在这三种细胞中发生转录。通过电子显微镜观察只在M-Fry细胞内发现有二十面体结构的ISKNV病毒粒子。利用对ISKNV敏感的M-Fry细胞,进行病毒部分基因的转录分析,获得ISKNV部分基因表达时相的同时,也证实M-Fry细胞可作为ISKNV全基因组转录时相分析的有力工具,为ISKNV全部ORF的划分、聚类提供更多实验依据。
TFV病毒已知其有多种鱼类敏感细胞系。由于斑马鱼胚胎细胞系ZF4的建立使其成为体外及细胞水平研究的有力工具,本论文进行了TFV对ZF4的感染实验。研究发现ZF4细胞在感染TFV之后会出现典型的CPE,并且通过透射电镜观察到在ZF4细胞内晶格状整齐排列的TFV病毒粒子以及通过出芽方式正在释放中的病毒;另外逆转录PCR及免疫荧光实验证实该病毒确实在ZF4细胞中发生转录及蛋白合成。本研究为今后将模式动物-斑马鱼引入鱼类虹彩病毒的研究中奠定了基础。