背景核仁是位于细胞核中的一个非膜性细胞器,是核糖体生物合成的场所,在细胞蛋白质的合成以及细胞的增殖、分化与衰老等生命活动中发挥重要作用。最近的研究表明,核仁还可以感受细胞的应激刺激,参与细胞的应激反应,称为核仁应激。在结构上,应激后的核仁主要有两个方面的变化：完整核仁结构瓦解,一些核仁蛋白(如NPM和NS)从核仁转位到核质。Nucleostemin(NPM)是核仁特异性的蛋白,正常情况下只定位于核仁中,核仁应激时从核仁转位到核质,起到感受细胞应激的作用,NPM蛋白转位到核质,被认为是核仁应激的标志性事件。在细胞功能方面,目前认为核仁应激发生一个主要作用是改变细胞肿瘤抑制因子P53的稳定性,核仁应激通过阻断P53结合E3泛素连接酶MDM2,导致P53泛素化下降和活性降低,引起P53降解减少积累增加。新出现的证据表明,核仁应激反应的发生可能与心血管疾病和神经退行性疾病的发病机制有关系。值得注意的是,有研究报道,辐射诱导的DNA损伤本身不能触发P53稳定性变化,除非核仁结构也被破坏了；此外,迫使核仁瓦解在无基因毒性应激时也能改变P53的稳定性,这些证据表明核仁的应激反应是P53调控的充分必要条件。哺乳动物的SIRT1蛋白是酵母SIR2基因产物的同源蛋白,是一类NAD+细胞依赖的去乙酰化酶家族的成员之一。SIRT1通过参与调节细胞的应激反应,起到调节糖脂代谢、细胞周期调控、对抗细胞衰老、抑制炎症及氧化应激损伤多方面的保护作用。研究发现,SIRT1的亚细胞定位对SIRT1的细胞生物学作用有重大影响。SIRT1被认为是核蛋白,虽然它也出现在胞质中。最近,村上教授和同事们的研究表明,SIRT1通过作用于核仁的蛋白质复合体(称为eNoSC-耗能式核仁的沉默复合体),感受细胞内的能量状态和控制核糖体RNA转录。该研究提示SIRT1还可能参与调节核仁的功能。尽管如此,SIRT1对核仁应激反应的作用和机制尚没有研究。SIRT1的生物学作用由转录依赖和转录非依赖两种途径介导。广泛的研究证明,肿瘤抑制基因P53是SIRT1众多的靶蛋白的其中一员,在介导SIRT1的生物学作用上至关重要。SIRT1是P53的负调控因子,SIRT1可以在K382位点去乙酰化P53,而去乙酰化P53蛋白C端的关键赖氨酸残基已经被普遍认为能够抑制P53的功能。SIRT1对P53功能的抑制可能是其抗衰老和抗凋亡作用的一个主要机制。除了直接调节P53功能,SIRT1也影响P53蛋白的胞内积累。例如,敲除SIRT1基因或用siRNA干扰SIRT1的表达可以使细胞P53蛋白含量增加。另外,microRNA-34a抑制SIRT1表达的效应会导致乙酰化P53的积累。SIRT1调控P53蛋白积累的机制目前仍存在争论。虽然初步证据表明SIRT1可能通过去乙酰化P53来增加P53泛素化的水平进而加速其降解,但是有研究发现将P53去乙酰化的位点全部突变之后,P53依然积累,这些体外和体内的研究都不支持乙酰化／去乙酰作用在P53的稳定性方面的重要作用。本研究的目包括以下两方面：(1)明确核仁应激反应是否存在于血管细胞中,以及核仁应激反应是否对不同的刺激存在特异性；(2)探讨SIRT1对细胞核仁应激的作用和机制,明确SIRT1-核仁应激途径是否可以为SIRT1介导的不依赖乙酰化作用的P53稳定性的调控机制提供一个合理的解释。本论文包括以下五部分内容：第一部分：血管细胞的核仁应激反应第二部分：SIRT1对细胞核仁应激反应的作用第三部分：SIRT1改善核仁应激反应的机制第四部分：SIRT1可能通过非去乙酰化的机制调节P53富集第五部分：心血管疾病中的核仁应激现象第一部分：血管细胞中的核仁应激反应研究目的1.研究不同应激刺激(ACTD, H2O2,热休克,血清饥饿和氨基酸饥饿)对于Hela细胞核仁应激的影响。2.研究在不同的应激刺激下血管细胞(HUVEC, HSMC)能否发生核仁应激。研究方法1.细胞培养：Hela细胞用高糖DMEM(含10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素)贴壁培养。HUVEC为人脐静脉内皮细胞,用ECM(含10%胎牛血清+1%青霉素／链霉素+1%生长因子)贴壁培养。HSMC为人平滑肌细胞,用高糖DMEM(含10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素)贴壁培养。2.核仁应激反应检测：用ACTD(5nM)刺激Hela细胞、HUVEC及HSMC 6.12,24小时；用H202刺激Hela细胞、HUVEC及HSMC,分别设计浓度梯度(0, 10μM,30μM,60μM, 100μM,300μM,600μM,1200μM)和时间梯度(0,2、4、8、12小时),以确定应激反应最佳浓度和时间。用无胎牛血清的培养基培养细胞制造血清饥饿模型,培养Hela细胞、HUVEC及HSMC 6、12、24小时；用HBSS代替培养基培养细胞制造血清饥饿模型,培养Hela细胞、HUVEC及HSMC6、12、24小时；42℃,45℃培养细胞制造热休克模型,培养Hela细胞、HUVEC及HSMC1、2、4小时,对于以上处理的细胞应用免疫荧光的方法检测核仁特异性蛋白NPM和NS的变化,根据免疫荧光染色图片计算细胞刺激后NPM核质核仁荧光强度比和细胞完整核仁百分数的变化,以此来评价核仁应激的发生。分别用ACTD(5nM)和H2O2(Hela-600μM)刺激Hela细胞,收集细胞后,应用RT-PCR的方法检测核仁应激相关因子pre-rRNA的水平,应用Western blot方法检测细胞P53表达的变化。3.统计学分析：数据用均数±标准误表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,非配对t检验或单因素方差分析(ANOVA)分别分析两组和多组数据,P<0.05认为有统计学意义。研究结果1.ACTD刺激能诱导Hela细胞、HUVEC及HSMC发生核仁应激反应。2.H2O2刺激能诱导Hela;细胞、HUVEC及HSMC发生核仁应激反应。3.血清饥饿不影响Hela细胞核仁形态,血清饥饿可以诱导HUVEC和HSMC发生核仁应激反应。4.氨基酸饥饿能诱导Hela细胞、HUVEC及HSMC发生核仁应激反应。5.热休克能诱导Hela细胞、HUVEC及HSMC发生核仁应激反应。6. ACTD和H202刺激都能降低Hela细胞pre-rRNA表达水平。7. ACTD刺激促进Hela细胞P53蛋白的富集。研究结论1.在应激刺激情况下血管细胞中(HUVEC, HSMC)的确存在核仁应激的现象。2.虽然不同细胞发生核仁应激的刺激条件可能存在差异,我们的结果支持核仁应激是细胞应激条件下的一个普遍反应,对不同刺激条件的特异性不明显。第二部分：SIRT1对细胞核仁应激反应的作用研究目的明确SIRT1能否影响不同刺激引起的核仁应激反应研究方法1,为了阐明SIRT1能否干预核仁应激的发生,本研究采用了四种方法改变Hela细胞SIRT1的水平：通过转染SIRT1-Flag来过表达SIRT1(转染pEGFP质粒为对照)；通过转染si-SIRT1来沉默SIRT1的表达(转染si-nc为对照)；提取SIRT1-/-小鼠主动脉平滑肌细胞(以小鼠平滑肌细胞系为对照)；应用SIRT1激活剂Resveratrol(以Resveratrol的溶剂DMSO为对照)来增加细胞SIRT1蛋白的活性。干预SIRT1水平后,分别应用ACTD和H202刺激细胞,免疫荧光方法检测细胞核仁的变化。2,蛋白印迹实验Western blotting检测：提取Hela细胞蛋白,检测SIRT1蛋白表达水平。3,统计学分析：数据用均数±标准误表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,非配对t检验或单因素方差分析(ANOVA)分别分析两组和多组数据,P<0.05认为有统计学意义。研究结果1,下调SIRT1的水平促进核仁应激的发生小干扰RNA下调SIRT1的表达后,Hela细胞的核仁并没有发生应激反应,但是分别加用H202和ACTD刺激后,在相同的刺激时间点,与单纯应用药物刺激组相比,NPM更早出现核质转位,核质核仁荧光强度比更高,完整核仁百分比例更小,核仁应激的发生更早。SIRT1-/-小鼠主动脉平滑肌细胞的核仁结构虽然没有破坏,但是在基础状态下NPM的染色已经出现在了核质中,加用H202刺激后,与普通小鼠平滑肌细胞相比,核仁应激发生更为严重。以上结果说明下调SIRT1的水平促进核仁应激的发生。2,上调SIRT1的水平抑制核仁应激的发生为进一步验证SIRT1对核仁应激的干预作用,我们通过转染SIRT1-Flag质粒来过表达野生型SIRT1,发现加用H202和ACTD刺激后,在相同的刺激时间,与单纯应用药物刺激组相比,核仁应激的发生更早,应激程度更为严重,说明上调SIRT1的水平抑制核仁应激的发生。研究结论SIRT1是核仁应激的负调控因子,抑制细胞核仁应激的发生。第三部分：SIRT1改善核仁应激反应的机制研究目的：1,探讨SIRT1调节核仁应激的生物学机制2,研究SIRT1与核仁之间的关系,SIRT1与核仁蛋白NPM是否共定位3,研究SIRT1是否去乙酰化NPM,探讨SIRT1与核仁蛋白NPM的关系。研究方法：1,细胞核仁的分离与鉴定：SIRT1抑制剂EX-527处理24小时的Hela细胞经低渗裂解分离细胞核,相差显微镜观察下,密度梯度离心分离细胞核仁,western blot检测核仁marker-NPM, NS, Fibrillarin;核质marker-Histone H3;细胞质marker-GAPDH,以验证提取核仁的纯度。2, SILAC-蛋白组学分析：一组Hela细胞用含有15N标记的精氨酸的SILAC DMEM培养基培养6代,另一组Hela细胞用一般DMEN培养,转染SIRT1-Flag质粒,两组按等细胞数混合,提取蛋白后,应用抗Flag的抗体进行免疫沉淀纯化,最后质谱鉴定,以筛选出Hela细胞中所有与SIRT1相结合的蛋白。3,免疫共沉淀：Hela细胞转染SIRT1-Flag质粒,提取蛋白,免疫共沉淀法检测外源性的SIRT1与NPM是否结合。Hela细胞转染pEGFP质粒(对照),H363Y质粒(无活性SIRT1)和SIRT1质粒(野生型),加用ACTD刺激24小时后提取蛋白,免疫共沉淀法检测NPM的乙酰化是否改变。Hela细胞提取蛋白,免疫共沉淀法检测内源性NPM与SIRT1是否结合4, Western Blot:Hela细胞转染pEGFP质粒(对照),H363Y质粒(无活性SIRT1)和SIRT1质粒(野生型),加用ACTD刺激24小时后提取蛋白,检测NPM,标签Flag, AC-lysine, β-Actin蛋白表达。Hela细胞EX-527处理24小时后,后提取蛋白,检测NPM, AC-lysine, β-Actin蛋白表达。5,免疫荧光法观察SIRT1在Hela细胞中的分布,检测SIRT1与核仁蛋白NPM是否共定位。6,为了研究SIRT1抑制核仁应激的作用是否依赖于它去乙酰化酶的活性,本研究采用了三种方法改变SIRT1的活性：应用SIRT1激活剂Resveratrol(以Resveratrol的溶剂DMSO为对照)预处理2小时,来增加SIRT1的活性；应用SIRT1抑制剂EX-527(以EX-527的溶剂DMSO为对照)预处理2小时,来抑制SIRT1的活性；转染无SIRT1活性的质粒H363Y来过表达没有活性的SIRT1(以转染pEGFP质粒为对照),然后用ACTD刺激细胞,免疫荧光方法检测细胞核仁的变化。7, NPM-pGEX质粒构建和转化：采用pGEX-4T-1质粒作为载体质粒,以NPM-GFP中NPM段作为目的片段,根据合适位点选取BamHI酶切,连接目的基因和载体质粒后,通过基因测序的方法验证NPM-pGEX质粒构建成功,然后将合成的NPM-pGEX质粒转化进入BL21感受态细菌。8, NPM-GST融合蛋白的大量表达和纯化：菌种种板,挑菌,摇菌4h,加融合蛋白诱导剂IPTG诱导1h,提取NPM-GST融合蛋白,加入resin-bead纯化蛋白,然后行SDS-PAGE电泳分离,考马斯亮蓝染色验证。9,体外乙酰化和去乙酰化实验：纯化的NPM-GST融合蛋白,加用CBP和乙酰辅酶A,在乙酰化反应混合液将NPM充分乙酰化,然后再加入SIRT1和NAD+,在去乙酰化反应液中孵育,收取纯化的NPM-GST融合蛋白,经过CBP处理的蛋白和经过CBP处理后又用SIRT1处理的蛋白,质谱分析结果。10, SIRT1 truncate实验：从GeneBank找到SIRT1-Flag质粒的序列,应用Overlap extension PCR的方法,分别truncate掉SIRT1的C端、N端和中间区域,得到三个带Flag标签的重组质粒(分别标为519、104、265),将它们和原始质粒SIRT1-Flag转染Hela细胞,48小时后收取细胞：(1)进行免疫沉淀实验,已检测SIRT1分子与NPM结合的具体部位；(2)加用ACTD (5nM)处理24小时,进行免疫荧光实验,检测truncate后的SIRT1是否还能保护核仁。11,统计学分析：数据用均数±标准误表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,非配对t检验或单因素方差分析(ANOVA)分别分析两组和多组数据,P<0.05认为有统计学意义。研究结果：1, SIRT1与核仁标记性蛋白NPM相结合。为研究SIRT1与核仁之间的关系,我们应用SILAC的方法,细胞蛋白质被含有15N标记精氨酸所标记,经免疫沉淀加质谱分析筛选出了Hela细胞中所有与SIRT1相结合的蛋白,其中就包括NPM。免疫共沉淀和WB检测显示外源转入的SIRT1可与NPM结合,细胞内源的NPM也可以与SIRT1结合。免疫荧光结果显示SIRT1与NPM的染色共定位。2, SIRT1在提取的Hela细胞核仁中部分表达。用Hela细胞提取到的核仁在相差显微镜下呈现为大小基本一致、形态较为规则的双折射的小点。为鉴定核仁的纯度,对提取的核仁蛋白和核质蛋白WB检测显示,Fibrillarin和NS在核仁蛋白中富集,Histone H3在核质蛋白富集,核仁蛋白几乎没有,说明提取的核仁没有核质的污染,GAPDH在核仁蛋白几乎没有,说明提取的核仁没有细胞质的污染。SIRT1主要分布在核质中,在核仁也有部分表达。3, SIRT1 truncate实验免疫沉淀实验结果发现,truncate过后,SIRT1104仍与NPM结合,SIRT1519仍与NPM结合,而SIRT1265不与NPM结合,说明只有SIRT1中间区域决定其与NPM相结合的功能。加用ACTD刺激后,而不与NPM结合的SIRT 1265失去了保护核仁抵抗应激的功能。4, SIRT1抑制核仁应激的作用只部分依赖于它去乙酰化酶的活性。我们发现,Hela细胞过表达没有活性的SIRT1和有酶活性的SIRT1,发现与对照组相比,两者都可以显著降低ACTD刺激后Hela细胞NPM的核质核仁荧光强度比,明显增加完整核仁的百分比例。说明SIRT1酶的活性在改善核仁应激的反应中并非具有唯一决定性的作用。过表达没有活性的SIRT1和有酶活性的SIRT1两组间相比,有酶活性的SIRT1组完整核仁的百分比例更高,有统计学差异,以上实验说明SIRT1酶活性在其参与改善核仁应激的过程中起部分作用。为彻底失活SIRTI,我们先用SIRT1抑制剂EX-527预处理细胞后,再过表达无酶活性的SIRT1和有酶活性的SIRT1,发现与对照组相比,两组结果类似,都能引起NPM免疫荧光染色的P/L明显降低,完整核仁的百分比例显著增加,两组间没有差异,说明SIRT1抑制核仁应激的作用只是部分依赖于它去乙酰化酶的活性。5, SIRT1没有显著影响Hela细胞的NPM乙酰化。过表达野生型SIRT1和无活性的SIRT1后,提取细胞总蛋白,用抗Ac-lysine的抗体进行Western blot检测,结果发现与对照组相比,细胞总蛋白乙酰化水平在过表达野生型SIRT1后下降,在过表达无活性SIRT1后升高,说明这两个质粒代表的SIRT1活性正确。应用SIRT1抑制剂EX-527处理Hela细胞24小时后,提取细胞核仁,用抗Ac-lysine的抗体进行Western blot检测,结果发现与对照组相比,细胞总蛋白,细胞质蛋白和核质蛋白的乙酰化水平增加,核仁蛋白的乙酰化水平也有所改变,说明此抑制剂EX-527和抗Ac-lysine抗体的特异性没有问题,而且SIRT1酶参与改变核仁蛋白的乙酰化。为进一步研究SIRT1能否去乙酰化NPM,在过表达野生型SIRT1和无活性的SIRT1后,收取蛋白,应用抗NPM的抗体进行免疫沉淀(IP),富集之后将所得到的蛋白进行Western blot检测,结果发现与对照组相比,Hela细胞乙酰化的NPM表达没有显著改变。既往的研究发现,NPM的C端有8个位点的赖氨酸可以被乙酰化。所以我们通过体外乙酰化和去乙酰化实验,研究在体外系统NPM是否能被乙酞化酶CBP乙酰化进而被去乙酰化酶SIRTI去乙酰化。质谱分析的结果显示,NPM在乙酰化酶CBP和乙酰辅酶A (Ac-CoA)都存在的条件下,可以被CBP乙酰化。当有SIRT1和辅酶NAD+都存在的条件下,NPM C端乙酰化的赖氨酸只有一个位点可以被去乙酞化。综合以上结果我们推测SIRT1介导的NPM去乙酰化在抑制核仁应激反应的作用中可能不起决定性作用。6, SIRT1能上调NPM蛋白水平。Western blot结果显示,与对照组相比,过表达野生型的SIRT1和无活性的SIRT1都能上调Hela细胞基础水平和ACTD刺激后的NPM蛋白表达,两组间结果比较,野生型的SIRT1作用更强。应用SIRT1活性的抑制剂EX-527后,NPM蛋白水平明显下降。由此可见,SIRT1去乙酰化酶的活性以及它的表达量都参与上调NPM蛋白水平。研究结论1, SIRT1在Hela细胞核仁中表达,与核仁蛋白NPM相结合2,与NPM结合的是SIRT1蛋白中间段,不与NPM结合后,SIRT1丧失了对核仁的保护作用。3, SIRT1抑制Hela细胞核仁应激只部分依赖于其去乙酰化酶的作用。4, SIRT1介导的NPM去乙酰化在抑制核仁应激反应中可能不起决定性作用。第四部分：SIRT1可能通过非去乙酰化的机制调节P53富集研究目的：1,研究SIRT1对核仁应激发生时P53表达的影响。2,探讨SIRT1影响细胞P53富集的机制。研究方法：1,免疫荧光法检测P53表达：PBS清洗细胞,冰甲醇4℃固定,1%BSA封闭,一抗(1%BSA配置)4℃孵育过夜,二抗(1%BSA配置)避光常温孵育1小时,DAPI细胞核染色,抗荧光淬灭分片剂封片。2, Western blot法检测P53表达：胰酶消化收取细胞后,裂解液裂解细胞提取蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,转移蛋白到PVDF膜上,封闭后一抗4℃过夜,然后二抗常温孵育2小时。ECL化学发光显影目的蛋白条带,LAS-4000化学发光仪检测,Image J软件进行条带分析。3,构建P53突变质粒：从Gene Bank中找到人野生型P53蛋白的氨基酸序列,然后根据文献找到P53蛋白中所有能够去乙酰化的位点共有8个,分别是K120、 K164、K370、K372、K373、K381、K382、K386,将这8个位点的精氨酸全部突变成赖氨酸,使之失去被乙酰化的能力,突变前后P53蛋白的密码子序列见附表,将这样的蛋白做成含有GFP标签的质粒P53 mutant (8KR).4,统计学分析：数据用均数±标准误表示,用SPSS13.0软件进行统计分析,非配对t检验或单因素方差分析(ANOVA)分别分析两组和多组数据,P<0.05认为有统计学意义研究结果：1, Hela细胞核仁应激的发生早于P53的积累。用ACTD刺激Hela细胞,设计时间曲线0,2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时,核仁应激最早发生在4小时,而Western blot显示P53积累大约发生在22小时。2, SIRT1抑制核仁应激引起的P53富集。免疫荧光和WB方法发现,ACTD刺激Hela细胞能引起P53蛋白水平增加,过表达SIRT1能明显降低P53的富集。3, SIRT1能通过不依赖于去乙酰化作用调节P53富集。免疫荧光和WB方法发现,与对照组相比,在ACTD刺激后,过表达野生型SIRT1和没有活性的SIRT1都能明显降低P53的富集,两组间比较发现,过表达野生型SIRT1下调P53的作用更强烈。先用SIRT1抑制剂EX-527预处理细胞再过表达无酶活性的SIRT1,可以彻底灭活SIRT1,我们发现这样的SIRT1依然能明显降低P53的富集,由此可见,SIRT1抑制P53富集的作用不完全依赖于SIRT1去乙酰化酶的活性。Hela细胞转染突变得到的P53 mutant (8KR)-GFP质粒,这样转入细胞的P53不能被去乙酰化,因此不受SIRT1活性的影响。实验结果发现在此基础上过表达野生型SIRT1和无活性的SIRT1能降低外源P53表达水平,这样进一步证实了SIRT1可以不依赖于去乙酰化作用调节P53的水平。研究结论：SIRT1抑制核仁应激引起的P53富集,这个过程可能不依赖于SIRT1去乙酰化作用。第五部分：心血管疾病中的核仁应激现象研究目的：探讨在心血管疾病的动物模型上是否存在核仁应激现象。研究方法：1,心肌肥厚动物模型：8周龄雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华公司。12周龄的雄性小鼠被选择进入实验研究,随机分为3组：假手术组、TAC-2周组、TAC-4周组。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。通过对小鼠进行主动脉缩窄术建立心肌肥厚模型。2,心肌肥厚动物超声心动图检测：建立小鼠TAC动物模型前1天及术后4周进行心脏超声检测,测量左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、室间隔厚度、左室后壁厚度,并计算左室射血分数、左室短轴缩短率、左室重量。3,组织免疫荧光检测：留取实验小鼠心脏标本,制作石蜡切片,组织免疫荧光染色检测心肌NPM表达和定位情况,计算心肌细胞NPM核质核仁荧光强度比和细胞完整核仁百分数。4,统计学分析：计量数据均以均数±标准差表示,两组之间比较采用独立样本的t检验；多组之间比较采用one-way ANOVA检验及q检验。若P<0.05为有统计学意义。研究结果：心肌肥厚失代偿期的小鼠心肌细胞发生核仁应激。压力超负荷诱导心肌重构的发生和发展。依据心脏超声检测结果,TAC术后2周发生代偿性心肌肥厚,术后4周发生失代偿性心肌肥厚、心力衰竭。NPM免疫荧光结果显示,TAC-2周组心肌细胞核仁结构尚完整,NPM核质核仁荧光强度比略有增加,而TAC-4周组心肌细胞核仁结构瓦解,NPM从核仁转位到核质,发生了核仁应激。研究结论：心肌肥厚失代偿期的小鼠心肌发生核仁应激。背景血管内皮细胞对于维持血管正常的结构和功能稳态具有举足轻重的作用。内皮细胞正常的生物学功能对血液流动造成的剪切应力的刺激具有高度的敏感性。剪切力作用于内皮细胞的表面,被认为是最重要的血管活性因素之一。大量的研究证据表明,层流状态的血流及一定强度的稳定的剪切力(生理状况的剪切力)对内皮细胞具有保护作用,而非正常的剪切力(过低或者震荡型剪切力),即病理状况的剪切力,对内皮细胞具有破坏作用,引起内皮功能异常和多种血管疾病。机械应力刺激引起的细胞内信号传导过程涉及多种细胞内的信使分子和信号传导蛋白,它们选择性的调节很多重要的内皮功能,比如基因表达,增殖,迁移,形态发生,通透性,炎症反应,血栓形成及毛细血管新生等重要生理功能。自噬是进化过程中高度保守的一种细胞应激反应。自噬一种细胞自我消化的过程,负责完成对未折叠蛋白和受损伤的细胞器的清除降解。自噬过程主要依赖于自噬小体的形成,自噬小体是具有双层膜的囊泡结构,包裹运送受损的细胞组分。自噬过程需要一系列自噬相关蛋白的表达,气质关键的一些分子包括LC3A, beclin-1, Atg5, Atg7和Atg12等。自噬小体形成后,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,通过各种水解酶的作用在酸性环境下将细胞组分消化降解。经典的自噬诱导因素是细胞代谢应激(例如氨基酸饥饿),在这种情况下,Akt-mTOR通路受到抑制,从而启动自噬反应,因此mTOR通路在自噬反应中具有中心作用。在内皮细胞中,自噬反应可以被多种应激因素诱导。根据应激刺激的形式,强度以及细胞所处的环境不同,自噬引起的结局可能不同,细胞存活或死亡。另外,有证据显示内皮细胞的自噬过程还参与调解其他重要的功能,包括细胞的衰老和毛细血管新生能力。因此,了解内皮细胞中自噬调节过程的分子机制,对于在应激状态下如何保护内皮细胞的生物学稳态具有重要的科学意义。然而,目前对于剪切力和内皮细胞自噬功能之间的关系还没有任何研究报道。哺乳动物的SIRT1蛋白是酵母SIR2基因产物的同源蛋白,是一类NAD+细胞依赖的去乙酰化酶家族的成员之一。SIRT1在调节细胞的应激反应中扮演重要角色。在内皮细胞中,许多研究证据表明SIRT1在维持细胞正常功能当中具有多方面的保护作用。例如SIRT1能和内皮一氧化氮合酶结合,使其去乙酰化并增加一氧化氮的释放。另外,激活的SIRT1还能介导内皮细胞的抗炎症作用并对抗细胞衰老。有证据显示SIRT1可以调节自噬。综上所述,目前一个未知的科学问题是剪切力可能通过调节SIRT1来影响内皮细胞自噬反应。目的1,研究剪切力对内皮细胞自噬反应的影响。2,探讨SIRT1在介导内皮细胞自噬反应中的作用及生物学机制。方法1,体外剪切力模型构建：人脐胙脉内皮细胞(HUVECs)种在铺有胶原的载玻片上,分为Flow组(剪切力组)和Static组(无剪切力组),模拟Frangos等设计的细胞层流装置,采用M199培养基作为流体,用剪切力(20 dyne/cm2)作用于HUVEC细胞制造层流剪切力模型,用剪切力(4 dyne/cm2)作用于HUVEC细胞制造低剪切力模型,用剪切力(振荡流±5 dyn/cm2 1 Hz)作用于HUVEC细胞制造震荡剪切力模型。2,检测自噬功能应用下列方法：(1)免疫荧光方法检测细胞LC3的定位,计数LC3的点状聚集,以LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比来评价自噬发生的严重程度。(2) RT-PCR检测自噬相关基因P62的表达。(3)WB检测自噬相关蛋白LC3、P62、ATG5、ATG7、FoxO1、mTOR的蛋白表达。3,免疫共沉淀法检测层流处理后自噬相关蛋白ATG5、ATG7、FoxO的乙酰化水平。4,应用Amplex red荧光法检测NADPH氧化酶抑制剂对层流处理后HUVEC ROS水平的影响。5,应用Caspase 3/7试剂盒检测在层流剪切力干预,或者应用各种自噬抑制剂时下HUVEC的凋亡情况。6,构建带有SIRT1荧光素酶报告基因的质粒,转染HUVEC细胞,用荧光素酶报告基因系统检测层流后SIRT1基因启动子的活性。结果1,免疫荧光检测发现生理状况下的层流剪切力诱导促进自噬,而低剪切力和振荡剪切力不促进自噬。2,时程分析和层流停止实验证实,层流剪切力引起的自噬反应并不是一个短暂的适应压力反应,而是一个持续的生理作用。3,氨基酸饥饿引起HUVEC自噬反应的发生,类似层流剪切力引起的自噬,可以用作阳性对照。4,层流剪切力增加P62的转录,但没有改变P62的蛋白水平。5,自噬抑制剂氯喹显著增加HUVEC LC3的含量。6,自噬后期的抑制剂Bafilomycin A1既能增加基础状况下HUVEC LC3的含量,又能增加层流剪切力后HUVEC LC3的含量。7,层流剪切力不改变HUVEC mTOR的磷酸化水平。8,层流剪切力增强HUVEC基因启动子的活性。9, SIRT1去乙酰化酶的活性在其调节细胞自噬的过程中起重要作用。10,层流剪切力内皮细胞自噬反应的调节是氧化还原依赖的。层流剪切力显著增加活性氧的产生,这个作用可以被NADPH氧化酶抑制剂阻断。活性氧的清除剂EUK-134和抗氧化剂NAC阻断层流剪切力对SIRT1和LC3蛋白表达的上调。11, SIRT1依赖的FoxO1激活在层流剪切力介导的自噬调节中是至关重要的。层流剪切力降低FoxO1乙酰化水平,过表达持续活化的FoxO1能明显增加HUVECLC3的含量。12,层流剪切力降低自噬相关蛋白ATG5和ATG7的乙酰化水平。13,自噬反应对内皮细胞有保护作用。自噬抑制剂3-MA加重血清饥饿引起的HUVEC细胞凋亡,3-MA阻断层流剪切力介导的自噬发生。转染小干扰RNA沉默ATG5表达部分减弱了白藜芦醇在血清饥饿引起的细胞凋亡的细胞保护作用,ATG5基因沉默也部分扭转应用细胞凋亡诱导剂时层流剪切力发挥的细胞保护作用。结论：层流剪切力通过氧化还原反应和依赖SIRT1的机制促进内皮细胞自噬。内皮细胞中剪切力诱导的自噬可能是层流血液流动保护血管作用的一种新机制。