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树突状细胞(DC)是免疫系统中具有多种免疫功能的关键细胞,但在HIV/AIDS患者体内,虽有大量病毒及抗原存在,却不能有效地激发特异性免疫应答。最新的研究显示,HIV/AIDS血源和性传染的途径虽有不同,但DC均是早于T细胞而最先遭受感染的“第一靶细胞”。已知辅助蛋白(Nef、Rev、Tat、Vif、Vpr和Vpu)是HIV-1在宿主细胞内复制和致病的根本因素。而哪种辅助蛋白、如何影响DC功能,至今研究结果甚少,结论杂乱不一。
本论文作为HIV-1影响DC功能研究的实验体系部分,旨在为系统比较研究6个辅助蛋白对DC功能的调节和机理奠定基础。采用分子生物学和免疫学技术方法,把辅助蛋白基因从DNA和mRNA水平导入目的细胞DC,在DC前体及其分化、成熟的各个时相,连续、动态地分析辅助蛋白对DC特征性表面标志及免疫相关基因的表达水平、摄取和处理抗原、激发和调控免疫应答等功能的影响,以期揭示HIV/AIDS患者DC功能明显异常和失调的原因。
首先,分别将6个辅助蛋白基因克隆到pEGFP-N2和pCS2+表达载体,得到具有绿色荧光蛋白融合基因的表达载体,将分别用于DNA和mRNA水平转染DC。再以K562细胞为模型建立mRNA转染细胞的基本方法;以人外周血CD14单核细胞为前体,建立了体外“2+2”快速诱导DC的方法。最后,利用Amaxa转染系统,从DNA水平研究辅助蛋白对DC前体(单核细胞)的功能影响。发现单核细胞转染辅助蛋白与GFP融合基因5h后,胞内蛋白大量表达,且能维持表达48h;其中Nef Tat、Vpu、Rev、Vif Vpr表达效率分别为35.42%、34.42%、43.42%、17.07%、13.65%、10.29%;单核细胞转染基因后,表型CD14、HLA-DR、CD80、CD83、CD86、DC-SIGN没有明显的表达变化;转染Nef、Vpu、Rev辅助蛋白后,单核细胞有10%凋亡;Vpr能抑制单核细胞IL-10的分泌,Nef能促进分泌IL-6。
总之,通过构建辅助蛋白的表达载体,优化DC的体外培养过程以及mRNA转染方法,并成功将辅助蛋白导入DC前体,鉴定其表型和功能变化。为研究辅助蛋白影响DC的功能和机制建立了稳定而可行的实验系统。