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成纤维细胞生长因子1（Fibroblast growth factor 1，FGF-1）是成纤维细胞生长因子超家族成员之一，具有广泛的生物学作用，对多种类型细胞具有促分裂作用，并能促进血管的形成。近年研究结果表明FGF-1在多种肿瘤组织中高表达，提示FGF-1可能与肿瘤的发生和转移具有一定的相关性。本研究首先通过免疫组化分析了FGF-1在正常乳腺组织、良性纤维瘤和乳腺导管癌组织中的表达水平。结果显示，FGF-1在乳腺导管癌组织中高表达。推测FGF-1可以作为乳腺癌治疗的一个新的靶点。为此，本实验室制备了特异性针对FGF-1的杂交瘤，并从该杂交瘤中克隆了抗体轻链可变区基因(Variablelight chain，VL)和重链可变区(Variable heavy chainVH)基因，构建成单链抗体(scFv1C9)，以此作为中和FGF-1的工具。共表达GFP-scFv1C9与HA-FGF-1于MCF-7细胞中，免疫沉淀结果显示scFv1C9与FGF-1共沉淀，表明scFv1C9在体外有效结合抗原。为了分析scFv1C9的中和能力，通过慢病毒介导scFv1C9在MCF-7细胞中稳定表达预先中和FGF-1的生物学功能，再将细胞在体回输到NOD/SCID小鼠体内，分析诱发小鼠成瘤的能力。结果显示预先中和FGF-1明显地使MCF-7诱导肿瘤能力降低，进一步证明了FGF-1参与了乳腺癌的发生。为了分析scFv1C9中和FGF-1功能的生物学机制，随后将pEGFP-C1和pEGFP-scFv1C9分别转染到乳腺癌细胞MCF-7，免疫荧光染色表明，表达GFP的细胞中内源性的FGF-1分布于细胞质和细胞核，而表达GFP-scFv1C9的细胞内源性的FGF-1仅分布在细胞质。说明scFv1C9在MCF-7细胞中表达阻止了FGF-1进入细胞核。FGF-1具有两条信号通路，一条是经典的受体依赖型信号通路；另一条是依赖入核的胞内信号通路。由此我们推测scFv1C9影响FGF-1入核进一步会阻断FGF-1的胞内信号通路。pEGFP-C1和pEGFP-scFv1C9转染的MCF-7细胞周期分析结果显示，表达GFP的细胞周期分布为：G0/G1：57-58%，S：25-31%，G2/M：11-17%，表达GFP-scFv1C9的细胞周期分布为：G0/G1：73-82%，S：9-16%，G2/M：6-11%，其G0/G1期的细胞明显增多，表现出细胞衰老的表型，细胞增殖指数明显降低。进而，通过定量ELISA实验证明了scFv1C9的表达不影响FGF-1的胞外分泌。从而推测scFv1C9不影响FGF-1的受体依赖型信号通路。为了进一步证明scFv1C9过表达阻断了FGF-1胞内信号通路，首先通过RT-PCR证明FGF-1基因本身的表达水平没有受到影响。其次通过Western Blot实验分析了细胞周期负调控因子p21的表达，同时它也是FGF-1胞内信号通路的一个关键分子。结果scFv1C9的过表达可以上调p21的表达水平，上调表达的p21可以通过共表达FGF-1而被补救。总结以上这些结果我们可以得出：scFv1C9在MCF-7细胞中过表达可以靶向细胞内的FGF-1而阻止其进入细胞核，从而阻断FGF-1的胞内信号通路，表现为p21的表达水平上调而使细胞发生G1期阻滞。为了验证体内scFv1C9抑制肿瘤生长的功能，通过方波电穿孔技术介导其在实体瘤中表达而达到抑制肿瘤生长的目的。电转条件为100V/50ms/8pulses，一共进行5次重复治疗。每周测量小鼠体重和肿瘤大小，绘制生长曲线。小鼠体重曲线图显示小鼠体重一直处于缓慢增加的趋势说明小鼠的生长状态良好，所获得的实验数据比较可靠。治疗组肿瘤大小和重量与空白组和对照组相比具有明显的减低。肿瘤的生长曲线显示治疗组与对照组和空白组相比明显减慢。进一步肿瘤组织切片Ki-67指数和微血管密度分析结果表明scFv1C9治疗组的Ki-67指数和微血管密度均比对照组和空白组明显降低。说明scFv1C9在小鼠体内对乳腺癌具有很好的治疗效果。上述研究结果表明scFv1C9是FGF-1的有效抑制剂，可以在体内体外抑制肿瘤细胞的生长。综上所述，本研究工作通过一系列实验证明FGF-1是乳腺癌治疗的一个可行性靶点。利用scFv1C9中和FGF-1可以降低乳腺癌的发生。并且证明scFv1C9在MCF-7细胞中通过阻止FGF-1入核而导致其胞内信号通路阻断，从而使p21表达上调导致乳腺癌细胞阻滞在G0/G1期。进一步，通过活体电穿孔成功介导了scFv1C9基因在MCF-7移植瘤中的表达，结果表明scFv1C9的表达对MCF-7移植瘤的生长具有较好的抑制作用。这些研究结果为进一步研发乳腺癌治疗制剂奠定了良好的基础。