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乙型肝炎是全球范围的严重公共卫生问题,全球感染HBV人数已经超过4亿,我国更是慢性乙型肝炎高发区。目前的研究表明,HBV诱导机体免疫反应,直接或间接地改变肝脏细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡、坏死或癌变。其中,HBV X基因所编码的蛋白质HBx是一个重要的多功能调节因子,它通过调节转录活性、信号传导途径、基因毒性压力反应、蛋白质降解等方式,不仅影响HBV的复制和增殖,而且影响到宿主细胞的细胞周期调控、细胞凋亡以及细胞癌变。但HBx大部分作用的确切机制至今尚未阐明,许多研究结果互相矛盾,这可能与用于进行相关研究的抗HBx抗体的质量及转化的细胞系不同等因素有关。因此,制备高质量的抗HBx单克隆抗体可以给HBx功能机制的深入研究提供有力的工具,从而为HBV感染的防治及阻止HBV相关HCC的发生寻找新的思路。本课题的研究目的是通过构建和表达乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,获得重组HBx蛋白,用纯化后的重组蛋白作为抗原制备鼠源单克隆抗体,并鉴定其特性。我们通过PCR扩增HBV基因组中X基因,将目的基因和pGEX4T-2载体经ECoRI与XhoI酶切、纯化、连接后,构建含有目的基因的重组质粒。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),并以IPTG进行诱导表达。表达产物经GST-Sepharose-4B琼脂糖树脂纯化后,用Western blot检测其抗原性。以重组蛋白GST-HBx免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗HBx的单克隆抗体(mAb),采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。最后我们成功构建了重组表达质粒pGEX4T-2-HBX,经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为HBV X编码基因。经SDS-PAGE分析目的蛋白成功表达并获得纯化,Western blot检测显示目的蛋白具有良好的抗原性。通过杂交瘤技术获得两株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞AF5和DA12,其抗体亚类均为IgG1,腹水效价分别为1:106和1:108,相对亲和力AF5>105,DA12>106。ELISA相加实验结果显示两株mAb识别相同或相近的抗原表位。Western bolt检测证明我们获得的两株杂交瘤细胞所分泌的mAb特异性良好。综上所述,我们运用基因重组技术与原核表达方法获得了HBx融合蛋白,并成功对其进行了纯化,制备了抗HBx单克隆抗体。为我们进一步探讨HBx的生物学功能及其在HBV感染中的作用奠定了坚实的基础;为预防和治疗乙型肝炎,阻止HBV相关HCC的发生提供了新的思路。