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目的:室间隔缺损（Ventricular septal defect,VSD）是先天性心脏病的常见形式之一,在亚洲国家中约有30%发病率,室间隔缺损可单独出现,也可能是其他复杂心脏畸变如法洛四联症的内在症状之一。尽管临床诊疗技术逐年发展,部分病情严重的胎儿仍可能会出现流产现象,VSD病情较轻患儿也还是需要后续大量手术治疗干预,影响患者的生存质量,因此了解在胚胎发育期间室间隔缺损发生的相关机制存在重大的临床意义。多数的先天性心脏疾病都是多因素共同作用引起的,单个或多个基因异常突变与直接或间接的环境因素可协同引发室间隔缺损的产生,但是受限于如今对室间隔起源与发展的认知不够全面,参与VSD发展的具体机制目前依旧不明确。固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatory element-binding protein,SREBP）裂解激活蛋白（SREBP cleavage activating protein,SCAP）作为细胞内重要的胆固醇调节元件,通过感受胞内胆固醇水平调节SREBPs的激活水平发挥其对于维持胆固醇稳态的作用。前期课题主要聚焦于它在代谢性疾病发生发展中的作用,但是近年来许多研究发现,SCAP的缺失会导致部分器官的发育障碍甚至可能影响小鼠胚胎的存活率。我们课题组前期研究结果显示,构建的平滑肌特异性SCAP敲除小鼠（Smooth muscle22 alpha,SM22a阳性细胞SCAP特异性敲除）纯合子无法出生,进一步观察形态发现纯合子SCAP敲除小鼠存在明显的流出道以及心脏发育异常。本研究旨在研究在SM22a阳性细胞特异性SCAP敲除对心脏发育的影响,并对其机制进行初步的探索。方法:第一部分:首先采用Cre/loxp系统构建SM22a+细胞敲除SCAP的小鼠模型,将获得的SM22a-CreTg/+SCAPflox/+基因型小鼠相互交配获取SM22a-CreTg/+SCAPflox/flox型与野生型小鼠胚胎,取部分胚胎鼠尾采用加热裂解法获得DNA用于确定基因型,采用ROSA染色追踪E9.5、E10.5小鼠胚胎确定SM22a可在小鼠胚胎的表达范围,免疫荧光染色验证SCAP的敲除效率。检查E9.5-E18.5小鼠胚胎,统计纯合子、杂合子、野生型出生比例。体视镜检查不同时期SM22a-CreTg/+SCAPflox/+与野生型胚胎,剥离小鼠胚胎心脏确定形态学差异。为了进一步明确表型,我们对胚胎切片进行HE染色、免疫荧光染色以及免疫组化染色检测胚胎心脏发育情况。第二部分:收集E14.5胚胎心脏流出道与右心室进行转录组测序,后续进行差异表达基因分析(（Differentially expressed genes,DEGs）与GO（Gene ontology）富集分析,我们进一步选用RT-q PCR验证转录组测序结果。采用免疫荧光染色检测Notch1、N1ICD、Hey2、JAD1在SM22a-CreTg/+SCAPflox/+型与野生型小鼠胚胎心脏中相对表达情况。第三部分:采用稳定的CRISPR/Cas9依赖性敲除技术与短暂的si RNA干扰靶向m RNA技术构建SCAP敲低的人血管平滑肌细胞（h VSMCs）系。采用EDU荧光染色检测敲低后h VSMCs的增殖水平,采用蛋白免疫印迹法检测SCAP敲低后Notch信号通路蛋白水平的变化。免疫共沉淀法检测293T、m VSMCs、h VSMCs、m Heart中SCAP与Notch1是否存在相互作用;荧光共聚焦染色验证SCAP与Notch1在m Heart、h VSMCs的共定位情况。在E14.5天胚胎心脏切片与h VSMCs中采用免疫荧光检测SCAP表达受抑制后Notch1与高尔基体的共定位情况。SCAP转位抑制剂25-HC（25-Hydroxycholesterol）与DES（Desmosterol）梯度处理h VSMCs观察SCAP转运受抑后是否影响Notch信号通路的激活,采用去脂质处理或Neg R孵育激活SCAP转运,免疫蛋白电泳检测Notch信号通路的改变。免疫荧光检测SCAP转运抑制后Notch1在高尔基体的定位情况。结果:第一部分:ROSA染色显示SM22a-Cre在小鼠E9.5、E10.5胚胎心脏与背主动脉处表达,免疫荧光染色显示E9.5SM22a-CreTg/+SCAPflox/+型与野生型小鼠胚胎纯合子小鼠心脏中SCAP表达明显减低,表明自E9.5后SM22a-Cre介导的SCAP敲除在心脏与主动脉处起效。比对不同时期小鼠胚胎存活率结果发现自E16.5后均无纯合子小鼠胚胎出现,体视镜检查显示在E14.5 SM22a-CreTg/+SCAPflox/+型与野生型小鼠胚胎小鼠出现明显的苍白与发育滞后。进一步分析对比提示在E14.5纯合子小鼠胚胎心脏明显左移,存在形态异常,三维立体建模以及切片HE染色证明其异常是由m VSD导致,详细的组织学染色显示,纯合子小鼠右心室壁与主动脉壁的厚度明显低于野生型小鼠,同时E9.5的HE染色结果表明纯合子小鼠存在缩短的流出道。PCNA染色结果显示在E14.5纯合子小鼠右心室壁增殖明显减缓。免疫荧光检测PH3与a-actin在E9.5小鼠胚胎心脏的共定位,结果显示在纯合子小鼠心脏中共定位减少,提示SCAP缺失后心脏平滑肌增殖受限。第二部分:转录组测序结果显示,相较于野生型小鼠,SM22a-CreTg/+SCAPflox/+型与野生型小鼠胚胎小鼠存在109个上调和164个下调的差异表达基因,基因GO分析显示胆固醇代谢和脂质代谢相关基因明显下调,先天免疫反应与细胞生长负调控相关基因在上调基因中富集,同时参与心脏小梁与流出道形态发生的相关基因表达减低,而在其中在心脏发育中发挥重要作用的Hey2基因在SCAP缺失纯合子小鼠中表达水平明显减低。RT-q PCR验证转录组测序结果,在E14.5心脏切片进行免疫荧光染色（Notch1、N1ICD、Hey2、JAD1）进一步确认SCAP敲除显著影响Notch信号通路在胚胎心脏的激活。第三部分:蛋白免疫印迹结果显示采用CRISPR/Cas9技术与si RNA干扰技术成功构建SCAP敲低的h VSMCs细胞,EDU染色结果显示SCAP的表达异常影响h VSMCs的增殖能力。蛋白免疫印迹法显示Notch信号通路的受体全长蛋白水平无明显异常,但是与激活相关的配体与下游蛋白表达明显受到抑制,提示与Notch1的激活相关。免疫共沉淀结果显示,Notch1与SCAP在多种细胞系与小鼠心脏组织中存在相互作用,共聚焦结果证实在心脏切片与h VSMCs中,SCAP与Notch1存在明显的核周共定位。免疫荧光分析显示Notch1在野生型胚胎心脏与h VSMCs中与高尔基体标记物Golgin97共定位,但是在SCAP敲低后,这种结合明显减弱,提示SCAP可能参与影响Notch1在高尔基体的定位。SCAP转运抑制剂与促进剂预处理h VSMCs后,检查Notch信号通路蛋白表达水平,结果显示Notch信号通路的激活水平与SCAP转运呈正相关,此外免疫荧光结果同样证明SCAP转运受抑可影响Notch1在高尔基体的定位。结论:在胚胎心脏发育过程中SCAP的缺失可影响Notch1在高尔基体上的转位,阻止其水解激活,Hey2作为Notch信号通路激活指标与心脏发育关键因子明显下调,最终导致胚胎出现明显的室间隔缺损,流出道变短,右心室壁变薄等心脏发育异常。