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卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,位居我国妇科恶性肿瘤死亡病因的榜首,5年生存率不足40%。由于卵巢癌疾病本身具有起病隐匿、进展迅速等特点,早期诊断卵巢癌较为困难,绝大多数患者因肿瘤晚期并发症方能发现本病,此时,患者已出现疾病进展或广泛转移,极大地降低了患者生活质量和生存期。因此,寻找卵巢癌发生发展中特异而高效的靶向分子一直都是国内外学者的研究热点。
Dysbindin蛋白,又名营养不良性短杆菌素结合蛋白,最初由Benson教授在研究肌肉营养不良症时发现。Dysbindin蛋白由DTNBP1基因编码,位于人类6号染色体(6p 22.3),可定位于胞浆和胞核内,全长351个氨基酸,分子量约为50kD,其在中枢神经系统和骨骼肌内含量最高。目前关于dysbindin功能的研究多集中于神经系统疾病中。研究发现:DTNBP1基因的单核苷酸多态性与精神分裂症的患病具有明确相关性。
有研究表明:在正常人体组织,如胃、肝脏、胰腺、肾、结肠、卵巢等均可见dysbindin的表达,提示dysbindin不仅在神经系统中可以发挥功能,在消化道和女性生殖系统也可能存在一定的功能。此外,另有学者发现dysbindin蛋白在肿瘤组织中高表达,其功能可能与促进肿瘤细胞侵袭迁移有关。目前关于dysbindin与恶性肿瘤的研究中,仅见于口腔鳞癌和胰腺癌中,陈勇教授等在胰腺癌的研究中,发现Dysbindin蛋白通过Akt信号通路促进胰腺癌细胞增殖,是胰腺癌潜在的肿瘤标志物,在胰腺癌的诊断和鉴别诊断中具有潜在的价值。另有学者通过检索NCBI数据库查询dysbindin与肿瘤的关系,并通过肿瘤大数据进行生物信息学分析发现:dysbindin蛋白在恶性肿瘤中具有较高的表达水平,功能富集分析提示dysbindin可能发挥促增殖和促转移作用,这其中就包括卵巢癌在内。
本研究旨在通过检测dysbindin在卵巢癌组织标本中的异常表达模式,并结合多种分子生物学技术,探讨dysbindin对卵巢癌细胞生物学行为的影响,寻找dysbindin在卵巢癌中发挥功能的潜在分子机制,为阐明卵巢癌的发病机制提供新的理论依据和潜在治疗靶点。
研究目的
1.通过临床标本分析dysbindin蛋白在卵巢癌中的表达并评估其与卵巢癌患者预后的关联;
2.研究卵巢癌细胞中dysbindin蛋白所发挥的生物学功能;
3.探究dysbindin蛋白是否促进卵巢癌细胞上皮间质转化从而促进肿瘤细胞侵袭迁移能力,是否通过ERK信号通路介导上皮间质转化;
4.阐明dysbindin蛋白通过ERK信号通路介导上皮间质转化促进卵巢癌侵袭转移的作用机制。
研究方法
1.利用免疫组化实验检测卵巢癌(226例)和正常卵巢(36例)石蜡组织中dysbindin的表达,利用RT-PCR和Westernblot检测dysbindin在卵巢癌(104例)和正常卵巢(36例)新鲜组织中的表达。
2.利用Cox风险回归模型分析评估影响卵巢癌患者预后的相关临床因素,利用Kaplan-Meier曲线绘制dysbindin蛋白表达与卵巢癌患者预后之间的关系。
3.利用RT-PCR和Westernblot实验检测dysbindin在卵巢癌细胞中的表达,利用慢病毒感染技术分别构建稳定上调和下调dysbindin表达的卵巢癌细胞系,并通过RT-PCR和Westernblot验证感染效率。
4.体外实验:利用MTT实验、平板克隆形成实验和细胞周期检测明确dysbindin对卵巢癌细胞增殖功能的影响;利用流式细胞仪检测明确dysbindin对卵巢癌细胞凋亡功能的影响;利用Transwell和划痕实验明确dysbindin对卵巢癌细胞侵袭转移功能的影响;利用倒置相差显微镜观察dysbindin对卵巢癌细胞胞体及伪足的影响。
5.体内实验:利用裸鼠皮下成瘤动物模型明确dysbindin对卵巢癌细胞增殖功能的影响,利用裸鼠腹腔肿瘤转移动物模型,明确dysbindin对卵巢癌细胞侵袭转移功能的影响。
6.利用RT-PCR和Westernblot实验明确dysbindin表达对卵巢癌细胞中EMT相关分子如E-cadherin、N-cadherin、vimentin表达的变化。
7.利用Westernblot实验检测dysbindin表达对卵巢癌细胞中ERK信号通路和Akt信号通路相关蛋白的表达变化,明确dysbindin与ERK信号通路的关系。
8.利用抑制试验(加入ERK磷酸化抑制剂U0126和回复实验),明确dysbindin表达与ERK磷酸化水平的相关性,阐明dysbindin是否通过ERK通路介导EMT发挥促进卵巢癌侵袭转移的作用机制。
研究结果
1.上皮性卵巢癌临床标本中dysbindin的表达水平:①在包含226例卵巢癌和36例正常卵巢的组织芯片中,173例(76.5%)卵巢癌样本为高表达,53例(23.5%)为低表达,36例正常卵巢样本均为低表达。高表达组的免疫组化染色评分显著高于低表达组和正常卵巢组,差异有统计学意义(P?0.0001),而低表达组和正常卵巢组之间无统计学差异(P=0.384)。②在包含104例卵巢癌和36例正常卵巢新鲜组织的队列中,RT-PCR发现:卵巢癌组织中dysbindin的mRNA表达明显高于正常卵巢组织,差异有统计学意义(P?0.0001)。Westernblot发现:卵巢癌组织中dysbindin的蛋白表达同样明显高于正常卵巢组织,差异有统计学意义(P?0.0001)。③通过对dysbindin表达与卵巢癌患者临床病理资料的关联分析发现:dysbindin表达与卵巢癌患者的FIGO分期,腹水形成及淋巴结转移密切相关。④Cox风险回归提示:dysbindin蛋白表达是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素。⑤Kaplan-Meier曲线发现:高表达dysbindin的卵巢癌患者5年总生存率明显差于低表达组(P=0.0016),差异有统计学意义。
2.①Dysbindin在多株卵巢癌细胞中呈现高表达,表达水平由低到高分别为A2780、8910、CAOV3和SKOV3;②分别利用表达最低的A2780和最高的SKOV3细胞构建稳定上调dysbindin的细胞系(A2780-OE和A2780-vector),下调dysbindin的细胞系(SKOV3-NC,SKOV3-RNAi-1和SKOV3-RNAi-2)。
3.细胞功能学体外实验:①细胞增殖能力检测:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,细胞的MTT摄取能力明显增强,克隆球形成数明显增多,S期细胞比例明显增多;而下调dysbindin后,结果反之;②凋亡能力检测:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,早期凋亡+晚期凋亡细胞比例明显减少;而下调dysbindin后,该比例明显增多;③细胞侵袭迁移能力检测:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,细胞的迁移和侵袭能力均明显增强;而下调dysbindin后,明显减弱;④细胞形态观察:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,细胞的伪足明显变长变多。
4.细胞功能学体内实验:①裸鼠皮下成瘤实验:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,裸鼠皮下出现肿瘤的时间更早,瘤体的体积更大,重量更重;而下调dysbindin,结果反之;②裸鼠腹腔肿瘤转移实验:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,腹腔内转移结节数量明显增多;而下调dysbindin,腹腔内转移结节数量明显减少。
5.EMT相关分子检测:①RT-PCR提示:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,上皮细胞标志物E-cadherinmRNA水平下调,间质细胞标志物N-cadherin和VimentinmRNA水平上调;而下调dysbindin后,结果反之;②Westernblot提示:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,上皮细胞标志物E-cadherin蛋白水平下调,间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin蛋白水平上调;而下调dysbindin,结果反之。
6.Westernblot提示:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,p38、phosph-p38和ERK表达水平无明显变化,而phosph-ERK水平明显升高;而下调dysbindin后,p38、phosph-p38和ERK表达水平依然无明显变化,而phosph-ERK水平明显降低。
7.①在卵巢癌细胞A2780中,上调dysbindin表达可以使phosph-ERK水平明显升高,加入ERK磷酸化抑制剂U0126后,phosph-ERK维持在较低水平,不再随着dysbindin表达的升高而升高;②划痕和Transwell实验回复验证:在A2780-OE细胞中加入U0126后,细胞的迁移和侵袭能力回复到与对照组A2780-vector类似的水平,高表达dysbindin不再增强细胞的侵袭和迁移能力。
研究结论
1.Dysbindin在卵巢癌组织中表达异常升高,并与卵巢癌的疾病进展密切相关;高表达dysbindin的卵巢癌患者预后较差,dysbindin表达可作为判断卵巢癌患者预后的一个独立危险因素。
2.Dysbindin高表达可以促进卵巢癌细胞增殖和侵袭转移,抑制凋亡,表明dysbindin在卵巢癌细胞的恶性生物学行为中发挥重要作用。
3.Dysbindin高表达可以降低E-cadherin表达,升高N-cadherin和Vimentin的表达,表明dysbindin可以促进卵巢癌细胞EMT转化,进而促进细胞侵袭转移。
4.Dysbindin在卵巢癌中的高表达可以促进ERK的磷酸化,而与p38信号通路无明显相关性,在加入ERK通路抑制剂U0126的回复实验中,同样得到验证。提示dysbindin可能是通过ERK信号通路参与调控EMT,进而促进细胞侵袭转移。
Dysbindin蛋白,又名营养不良性短杆菌素结合蛋白,最初由Benson教授在研究肌肉营养不良症时发现。Dysbindin蛋白由DTNBP1基因编码,位于人类6号染色体(6p 22.3),可定位于胞浆和胞核内,全长351个氨基酸,分子量约为50kD,其在中枢神经系统和骨骼肌内含量最高。目前关于dysbindin功能的研究多集中于神经系统疾病中。研究发现:DTNBP1基因的单核苷酸多态性与精神分裂症的患病具有明确相关性。
有研究表明:在正常人体组织,如胃、肝脏、胰腺、肾、结肠、卵巢等均可见dysbindin的表达,提示dysbindin不仅在神经系统中可以发挥功能,在消化道和女性生殖系统也可能存在一定的功能。此外,另有学者发现dysbindin蛋白在肿瘤组织中高表达,其功能可能与促进肿瘤细胞侵袭迁移有关。目前关于dysbindin与恶性肿瘤的研究中,仅见于口腔鳞癌和胰腺癌中,陈勇教授等在胰腺癌的研究中,发现Dysbindin蛋白通过Akt信号通路促进胰腺癌细胞增殖,是胰腺癌潜在的肿瘤标志物,在胰腺癌的诊断和鉴别诊断中具有潜在的价值。另有学者通过检索NCBI数据库查询dysbindin与肿瘤的关系,并通过肿瘤大数据进行生物信息学分析发现:dysbindin蛋白在恶性肿瘤中具有较高的表达水平,功能富集分析提示dysbindin可能发挥促增殖和促转移作用,这其中就包括卵巢癌在内。
本研究旨在通过检测dysbindin在卵巢癌组织标本中的异常表达模式,并结合多种分子生物学技术,探讨dysbindin对卵巢癌细胞生物学行为的影响,寻找dysbindin在卵巢癌中发挥功能的潜在分子机制,为阐明卵巢癌的发病机制提供新的理论依据和潜在治疗靶点。
研究目的
1.通过临床标本分析dysbindin蛋白在卵巢癌中的表达并评估其与卵巢癌患者预后的关联;
2.研究卵巢癌细胞中dysbindin蛋白所发挥的生物学功能;
3.探究dysbindin蛋白是否促进卵巢癌细胞上皮间质转化从而促进肿瘤细胞侵袭迁移能力,是否通过ERK信号通路介导上皮间质转化;
4.阐明dysbindin蛋白通过ERK信号通路介导上皮间质转化促进卵巢癌侵袭转移的作用机制。
研究方法
1.利用免疫组化实验检测卵巢癌(226例)和正常卵巢(36例)石蜡组织中dysbindin的表达,利用RT-PCR和Westernblot检测dysbindin在卵巢癌(104例)和正常卵巢(36例)新鲜组织中的表达。
2.利用Cox风险回归模型分析评估影响卵巢癌患者预后的相关临床因素,利用Kaplan-Meier曲线绘制dysbindin蛋白表达与卵巢癌患者预后之间的关系。
3.利用RT-PCR和Westernblot实验检测dysbindin在卵巢癌细胞中的表达,利用慢病毒感染技术分别构建稳定上调和下调dysbindin表达的卵巢癌细胞系,并通过RT-PCR和Westernblot验证感染效率。
4.体外实验:利用MTT实验、平板克隆形成实验和细胞周期检测明确dysbindin对卵巢癌细胞增殖功能的影响;利用流式细胞仪检测明确dysbindin对卵巢癌细胞凋亡功能的影响;利用Transwell和划痕实验明确dysbindin对卵巢癌细胞侵袭转移功能的影响;利用倒置相差显微镜观察dysbindin对卵巢癌细胞胞体及伪足的影响。
5.体内实验:利用裸鼠皮下成瘤动物模型明确dysbindin对卵巢癌细胞增殖功能的影响,利用裸鼠腹腔肿瘤转移动物模型,明确dysbindin对卵巢癌细胞侵袭转移功能的影响。
6.利用RT-PCR和Westernblot实验明确dysbindin表达对卵巢癌细胞中EMT相关分子如E-cadherin、N-cadherin、vimentin表达的变化。
7.利用Westernblot实验检测dysbindin表达对卵巢癌细胞中ERK信号通路和Akt信号通路相关蛋白的表达变化,明确dysbindin与ERK信号通路的关系。
8.利用抑制试验(加入ERK磷酸化抑制剂U0126和回复实验),明确dysbindin表达与ERK磷酸化水平的相关性,阐明dysbindin是否通过ERK通路介导EMT发挥促进卵巢癌侵袭转移的作用机制。
研究结果
1.上皮性卵巢癌临床标本中dysbindin的表达水平:①在包含226例卵巢癌和36例正常卵巢的组织芯片中,173例(76.5%)卵巢癌样本为高表达,53例(23.5%)为低表达,36例正常卵巢样本均为低表达。高表达组的免疫组化染色评分显著高于低表达组和正常卵巢组,差异有统计学意义(P?0.0001),而低表达组和正常卵巢组之间无统计学差异(P=0.384)。②在包含104例卵巢癌和36例正常卵巢新鲜组织的队列中,RT-PCR发现:卵巢癌组织中dysbindin的mRNA表达明显高于正常卵巢组织,差异有统计学意义(P?0.0001)。Westernblot发现:卵巢癌组织中dysbindin的蛋白表达同样明显高于正常卵巢组织,差异有统计学意义(P?0.0001)。③通过对dysbindin表达与卵巢癌患者临床病理资料的关联分析发现:dysbindin表达与卵巢癌患者的FIGO分期,腹水形成及淋巴结转移密切相关。④Cox风险回归提示:dysbindin蛋白表达是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素。⑤Kaplan-Meier曲线发现:高表达dysbindin的卵巢癌患者5年总生存率明显差于低表达组(P=0.0016),差异有统计学意义。
2.①Dysbindin在多株卵巢癌细胞中呈现高表达,表达水平由低到高分别为A2780、8910、CAOV3和SKOV3;②分别利用表达最低的A2780和最高的SKOV3细胞构建稳定上调dysbindin的细胞系(A2780-OE和A2780-vector),下调dysbindin的细胞系(SKOV3-NC,SKOV3-RNAi-1和SKOV3-RNAi-2)。
3.细胞功能学体外实验:①细胞增殖能力检测:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,细胞的MTT摄取能力明显增强,克隆球形成数明显增多,S期细胞比例明显增多;而下调dysbindin后,结果反之;②凋亡能力检测:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,早期凋亡+晚期凋亡细胞比例明显减少;而下调dysbindin后,该比例明显增多;③细胞侵袭迁移能力检测:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,细胞的迁移和侵袭能力均明显增强;而下调dysbindin后,明显减弱;④细胞形态观察:在卵巢癌细胞中上调dysbindin后,细胞的伪足明显变长变多。
4.细胞功能学体内实验:①裸鼠皮下成瘤实验:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,裸鼠皮下出现肿瘤的时间更早,瘤体的体积更大,重量更重;而下调dysbindin,结果反之;②裸鼠腹腔肿瘤转移实验:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,腹腔内转移结节数量明显增多;而下调dysbindin,腹腔内转移结节数量明显减少。
5.EMT相关分子检测:①RT-PCR提示:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,上皮细胞标志物E-cadherinmRNA水平下调,间质细胞标志物N-cadherin和VimentinmRNA水平上调;而下调dysbindin后,结果反之;②Westernblot提示:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,上皮细胞标志物E-cadherin蛋白水平下调,间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin蛋白水平上调;而下调dysbindin,结果反之。
6.Westernblot提示:在卵巢癌细胞中上调dysbindin,p38、phosph-p38和ERK表达水平无明显变化,而phosph-ERK水平明显升高;而下调dysbindin后,p38、phosph-p38和ERK表达水平依然无明显变化,而phosph-ERK水平明显降低。
7.①在卵巢癌细胞A2780中,上调dysbindin表达可以使phosph-ERK水平明显升高,加入ERK磷酸化抑制剂U0126后,phosph-ERK维持在较低水平,不再随着dysbindin表达的升高而升高;②划痕和Transwell实验回复验证:在A2780-OE细胞中加入U0126后,细胞的迁移和侵袭能力回复到与对照组A2780-vector类似的水平,高表达dysbindin不再增强细胞的侵袭和迁移能力。
研究结论
1.Dysbindin在卵巢癌组织中表达异常升高,并与卵巢癌的疾病进展密切相关;高表达dysbindin的卵巢癌患者预后较差,dysbindin表达可作为判断卵巢癌患者预后的一个独立危险因素。
2.Dysbindin高表达可以促进卵巢癌细胞增殖和侵袭转移,抑制凋亡,表明dysbindin在卵巢癌细胞的恶性生物学行为中发挥重要作用。
3.Dysbindin高表达可以降低E-cadherin表达,升高N-cadherin和Vimentin的表达,表明dysbindin可以促进卵巢癌细胞EMT转化,进而促进细胞侵袭转移。
4.Dysbindin在卵巢癌中的高表达可以促进ERK的磷酸化,而与p38信号通路无明显相关性,在加入ERK通路抑制剂U0126的回复实验中,同样得到验证。提示dysbindin可能是通过ERK信号通路参与调控EMT,进而促进细胞侵袭转移。