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目的:金水宝胶囊(每粒含虫草菌粉0.33g)系冬虫夏草分离所得虫草菌的发酵制品。冬虫夏草甘温,入肺、肾经,具有补肾保肺、秘精益气之功效,对慢性支气管炎(chronic bronchitis,CB)具有较好的治疗效果,但其治疗作用机制尚未完全明确。本研究采用气管内滴注脂多糖(LPS)的方法复制CB大鼠模型,然后给予药物干预,检测大鼠血清、肺组织中促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β)及抗炎细胞因子IL-4、IL-10的含量变化,运用HE染色和SP免疫组织化学染色等技术手段,观察CB状态下支气管、肺组织病理形态学特征及金水宝胶囊对肺组织中cNOS表达的影响,探讨其作用机理。
方法:SD大鼠40只,按体重随机分为正常对照组(对照组,normal group)、CB模型组(模型组,model group)、金水宝低剂量组(低剂量组,low-dose group)、金水宝高剂量组(高剂量组,high-dose group)和桂龙咳喘宁对照组(桂龙组,guilong group,阳性对照用药)。每组8只,雌雄各半。
各组大鼠用1%的戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射,麻醉成功后,使其仰卧固定于操作台,暴露声门,以静脉套管针代替气管导管,拔除针芯,快速插入气管,将LPS200μg注入气管内;对照组大鼠气管内滴入无菌生理盐水0.5ml/只。喂养3周。
从第四周开始,对照组和模型组灌服生理盐水,容量为10ml/kg;低剂量组和高剂量组每日用药剂量分别为0.3g/kg(相当于临床成人用药量的7倍)、0.6g/kg(相当于临床成人用药量的14倍),以0.03g/ml和/或0.06g/ml的混悬液灌胃;桂龙组每日用药剂量0.9g/kg(相当于临床成人用药量的14倍),以0.09g/ml的混悬液灌胃。以上均为每日1次,连续3周。
检测样本制备:灌药3周结束后第2天,断头取血,立即以3500r/min离心5min,取血清,-20℃冻存待检。
肺组织匀浆的制备:将肺组织用冰生理盐水冲洗,滤纸吸湿后,称取湿重0.3g左右,加入预冷的生理盐水,用电动匀浆器研磨,镜检未见完整细胞,制成10%的肺组织匀浆。4℃6000r/min离心5min,提取上清液,用双缩脲法测定蛋白含量,-20℃冻存待检。
取右侧肺脏中部组织0.5cm×0.5cm,用10%甲醛(pH7.4磷酸盐缓冲液配制)固定,常规石蜡包埋,切片。
结果:
1.CB大鼠支气管、肺组织病理形态学改变
对照组可见细支气管粘膜上皮完整,细胞排列整齐,细支气管壁及肺泡无明显病理形态学改变(见Fig.1、2、3)。模型组可见细支气管管腔增大,部分上皮细胞坏死脱落,周围可见大量以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润。肺泡上皮细胞部分坏死脱落,肺泡间隔明显增宽,伴有慢性炎细胞及少量中性粒细胞浸润等(见Fig.4、5、6)。
2.金水宝胶囊对CB大鼠血清和肺组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β含量的影响
2.1金水宝胶囊对CB大鼠血清和肺组织中TNF-α含量的影响
结果显示,与对照组(3.31±0.24,2.57±0.26)比较,模型组大鼠血清和肺组织中TNF-α含量(4.23±0.20,3.57±0.37)均明显升高(P<0.01);与模型组比较,高剂量组血清和肺组织中TNF-α含量(3.43±0.47,3.13±0.43)均明显降低(P<0.05或P<0.01),桂龙组血清中TNF-α含量(3.69±0.21)也明显降低(P<0.05);与低剂量组血清中TNF-α(3.91±0.50)比较,高剂量组含量也明显降低(P<0.05)。见 Table1。
2.2金水宝胶囊对CB大鼠血清和肺组织中IL-1β含量的影响
结果显示,与对照组(2.13±0.06,2.20±0.12)比较,模型组大鼠血清和肺组织中IL-1β含量(2.29±0.06,2.64±0.17)均明显升高(P<0.01);与模型组比较,高剂量组(2.27±0.08,2.33±0.12)和桂龙组(2.27±0.07,2.45±0.09)血清和肺组织中IL-1β含量均显著降低(P<0.05或P<0.01),低剂量组肺组织中IL-1β含量也显著低于模型组(P<0.01)。各治疗组间比较,桂龙组血清和高剂量组肺组织中IL-1β含量较之低剂量组(2.29±0.07,2.48±0.08)显著降低(P<0.01),高剂量组肺组织中IL-1β含量较之桂龙组亦显著降低(P<0.05)。见 Table2。
3.金水宝胶囊对CB大鼠血清和肺组织中抗炎细胞因子IL-4、IL-10含量的影响
3.1金水宝胶囊对CB大鼠血清和肺组织中IL-4含量的影响
结果显示,与对照组(123.21±23.15,1.15±0.02)比较,模型组大鼠血清和肺组织中IL-4含量(44.28±18.49,1.08±0.01)均明显降低(P<0.01);与模型组比较,高剂量组(105.36±15.63,1.14±0.02)和桂龙组(83.50±21.23,1.11±0.04)血清和肺组织中IL-4含量均显著增加(P<0.05或P<0.01),低剂量组血清和肺组织中IL-4含量也明显高于模型组(P<0.05)。各治疗组间比较,高剂量组血清中和肺组织中IL-4含量较之低剂量组(66.23±32.07,1.11±0.03)明显增加(P<0.05或P<0.01),对肺组织中IL-4含量的影响亦显著高于桂龙组(P<0.05)。见 Table3。
3.2金水宝胶囊对CB大鼠血清和肺组织中IL-10含量的影响
结果显示,与对照组(25.63±2.97,8.06±0.65)比较,模型组大鼠血清和肺组织中IL-10含量(13.38±2.26,3.36±0.95)均明显降低(P<0.01);与模型组比较,低剂量组(20.26±4.11,5.33±0.48)和桂龙组(19.88±3.72,6.04±1.39)血清和肺组织中IL-10含量均显著增加(P<0.05),高剂量组肺组织中IL-10含量(6.38±0.79)也明显高于模型组(P<0.01)。各治疗组之间对血清和肺组织中IL-10含量的影响未见明显差异(P>0.05)。见Table4。
4.金水宝胶囊对CB大鼠肺组织cNOS表达的影响
对照组大鼠细支气管粘膜上皮细胞胞浆cNOS呈较强的阳性表达(Fig.7、8);模型组大鼠可见细支气管粘膜上皮细胞胞浆存在较弱的cNOS阳性反应信号,动脉管壁平滑肌细胞胞浆呈较强阳性表达(Fig.9、10)。阳性信号均呈棕黄色。
低剂量组与桂龙组细支气管粘膜上皮细胞胞浆呈现较弱的阳性反应(Fig.11、12,15、16);高剂量组cNOS表达呈现较强的阳性信号。与对照组相似,阳性反应主要见于细支气管粘膜上皮细胞胞浆(Fig.13、14)。
结论:
1.促炎细胞因子 TNF-α、IL-1β和抗炎细胞因子IL-4、IL-10自稳失衡,是慢性支气管炎发病的重要病理基础;
2.检测血清促炎细胞因子 TNF-α、IL-1β及抗炎细胞因子IL-4、IL-10水平可以作为慢性支气管炎临床诊断及评价疗效的重要依据;
3.CB状态下,cNOS在细支气管粘膜上皮细胞的表达受到抑制,并使内源性NO生成和释放减少,从而促进支气管收缩;
4.金水宝胶囊可以通过抑制促炎细胞因子的分泌,并增强抗炎细胞因子的活性,来调节促炎、抗炎细胞因子的失衡状态,恢复其自稳机制;
5.金水宝胶囊能有效调节肺组织中cNOS的表达,对CB产生治疗作用。