目的:1.建立生物样品中二氢杨梅素(DMY)的定量分析方法。2.研究DMY经口给药后在Beagle犬体内的药代动力学和毒代动力学。3.研究大鼠灌胃DMY后的药代动力学和组织分布。方法:1.生物样品中DMY的定量检测方法:生物样品经乙酸乙酯(EtAc)液-液萃取,采用 ZORBAX Eclipse CDB-C18 ( 4.6 mm × 150 mm, 5 μm )柱分离,流动相为乙腈:0.1 %磷酸,梯度洗脱(0→13 min: 15 % : 85 %→38 % : 62 %,13→16 min: 38 % : 62 %, 16→20 min: 38 % : 62 %→15 % : 85 % ),进样量10μL,流速1.0mL/min,柱温25℃,在292nm处紫外检测,检测20min。以卡马西平(car)为内标,记录DMY和car的峰面积。以DMY峰面积和car峰面积比值为纵坐标(y),以DMY浓度为横坐标(x)进行回归分析,计算生物样品中DMY的浓度。2.血浆样品的制备:取动物血液,以肝素抗凝(8单位/mL全血),4000 r/min离心10 min,取上层清液,得血浆样品。取血浆样品500 μL置具塞玻璃试管中,玻璃试管置冰水浴中,每管依次加入car工作液5 μL,磷酸溶液10 μL,4000 r/min低温离心1min,旋涡振荡混匀。分别用EtAc1.0 mL、0.5 mL、0.5 mL旋涡振荡萃取3次,每次3 min,每次4000 r/min低温离心5 min,分别取上清液0.75 mL、0.5 mL、0.5 mL合并,25 ℃下用氮气流吹干,气流速度为每管0.7 L/min。样品用100μL甲醇旋涡振荡30 s溶解,4000 r/min低温离心3 min,取清液,即得。3.组织样品的制备:新鲜组织用超纯水冲净表面血污,以洁净滤纸吸干水分,称取湿重,眼科剪剪碎后按重量体积比(g : mL) 1 : 4加超纯水,用组织分散器以15000 r/min,分散30 s,制备匀浆,匀浆4000 r/min离心10 min,取上层清液,得组织匀浆。取组织匀浆500 μL置具塞玻璃试管中,玻璃试管置冰水浴中,每管依次加入car工作液5 μL,磷酸溶液10 μL, 4000 r/min低温离心1 min,旋涡振荡混匀。样品采用EtAc液-液卒取。其中第1次用EtAc1.0 mL,旋涡振荡萃取3 min,4000 r/min低温离心8 min,取上清液0.75 mL;第2、3次分别用EtAc0.5 mL,旋涡振荡萃取3 min,分别4000 r/min低温离心3 min,各取上清液0.5 mL,合并萃取液,25 ℃下用氮气流吹干,气流速度为每管0.7 L/min。残渣用100 μL甲醇旋涡振荡30 s溶解,4000 r/min低温离心3 min,取清液,即得。4. DMY经口给药后在Beagle犬体内的药代动力学研究:Beagle犬单次和分次经口给予DMY150 mg/kg,设给药前1个、给药后9个共10个时间点。各动物在清醒状态下,按时间点取血,制备血浆样品。血浆样品以确立的反相高效液相紫外检测(RP-HPLC-UV)方法测DMY浓度。血药浓度-时间数据采用DAS2.1软件处理,拟合DMY动力学参数,并对两种给药方式的动力学参数进行统计分析。5. DMY在大鼠体内的药代动力学研究:大鼠分为3剂量组,DMY分别按50、100、200 mg/kg灌胃给药。设给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8 h共10个采取点,按时间点处死动物取血,制备血浆样品。血浆样品以RP-HPLC-UV测DMY浓度。血药浓度-时间数据采用DAS2.1软件处理,拟合DMY动力学参数,并对3个剂量组的动力学参数进行统计分析。6. DMY大鼠组织分布研究:大鼠灌胃给予DMY,剂量为200mg/kg。设给药前和给药后0.33、0.67、1.5 h共4个组织采集时间点,按时间点处死动物,取肝、脑和肾,制备组织样品。以RP-HPLC-UV测组织DMY浓度,得组织浓度-时间数据。7. DMY在Beagle犬的毒代动力学研究:Beagle犬分3个剂量组,DMY分别按100、500、2500mg/kg的剂量灌胃给药。动物在清醒状态分别于首次和末次给药前和给药后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 h共9个时间点采血,制备血浆样品。血浆样品以RP-HPLC-UV测DMY浓度。血药浓度-时间数据采用DAS2.1软件处理,拟合DMY动力学参数,并对3个剂量组首次和末次给药的动力学参数进行统计分析。结果:1.血浆样品的制备与稳定性:EtAc对血浆中DMY的萃取率明显高于乙腈,温度较低时萃取率高;EtAc萃取3次时DMY萃取率接近80 %。氮气流吹干温度较低和时间较短时,DMY的回收率明显提高。DMY血浆样品在室温下放置1 h与冰冻2周稳定,室温下放置2 h或反复冻融不稳定。2.方法学考察:本试验建立的测定动物生物样品中DMY的RP-HPLC-UV方法系统适应性和专属性良好,方法的日内和日间的RSD均小于10 %,相对回收率均大于70 %。Beagle犬和大鼠血浆样品中的DMY在20～ 1000 μg/L范围内线性关系良好,相关系数r2>0.999,定量下限为40μg/L。大鼠的肝、脑和肾样品中的DMY在0.02 ～ 10 μg/g范围内线性关系良好,相关系数r2>0.999,定量下限为 0.04 μg/g。3. DMY经口给药后在Beagle犬体内的药代动力学研究:Beagle犬单次和分次经口给予DMY150mg/kg后,其体内过程个体差异大,但均属于二房室模型。单次给药0-t小时血药浓度-时间曲线下的面积(AUC0-t)为4332 μg/L·h,多次给药AUC0-t为253 μg/L·h。DMY经口给与Beagle犬后,其体内分布广泛,吸收较好;与单次给药比较,分次给药后吸收明显减少,消除明显加快(p均<0.05),且在体内未达到稳态,没有发生蓄积。4. DMY在大鼠体内的药代动力学研究:大鼠口服DMY50、100、200mg/kg后,血浆浓度和体内过程个体差异大。血浆DMY峰浓度(Cmax)随剂量增加而降低。给药后6～8 h,高剂量组血药浓度下降至Cmax的1/5～ 1/9,低剂量和中剂量组检测不到DMY。统计矩参数和分析结果显示,AUC,Cmax、血浆表观分布容积(V)和血浆清除率(CL)均随DMY剂量增加而显著增加(p<0.05 ),MRT、t1/2和Tmax均随DMY剂量变化而变化,但无统计学差异。5. DMY大鼠组织分布研究:大鼠口服DMY200 mg/kg后0.33h,即可在肝和肾中检测到DMY。在设定的时间内组织药物浓度随时间没有发生明显的变化。肾组织药物浓度高于肝组织药物浓度,脑组织在设定的时间点未检测到 DMY。6. DMY在Beagle犬的毒代动力学研究:Beagle犬分别以100、500、2500 g/kg的剂量单次或连续灌胃给药DMY后,所得药-时数据均符合二室模型。将DMY初次给药后所得的药-时数据进行拟合,三个剂量的CL分别为41、89、276 L/h/kg,V分别为82、218、726 L/kg。CL和V均与剂量关联非常显著(p<0.01)。三个剂量的AUC分别为2494、5546、9096 1g/L·h,AUC随剂量增加非常显著(p<0.01 )。Beagle犬连续灌胃给药DMY3个月,于末次给药后(第90天)取血,测定血浆药物浓度,经拟合三个剂量的CL分别为57、76、199 L/h/kg, V值分别为197、170、325 L/kg,且高剂量组的CL和V均比低、中剂量组的高;三个剂量的t1/2分别为2.18、1.54、1.1 h, t1/2随着剂量增加而降低,但与剂量无统计学相关性。三个剂量的AUC分别为1758、6528、12935 μg/L·h,AUC和剂量相关性非常显著(p<0.01)。和初次给药后相比,除低剂量组外,连续给药后的AUC增加,CL和V减少。结论:1.血浆样本中DMY受温度影响较大,采集的样本应尽快低温处理、冰冻保存。2.本研究建立的RP-HPLC-UV方法灵敏、准确,适用于DMY生物样本的测定及药代动力学研究。3.与DMY经口单次给药比较,Beagle犬分多次经口给予DMY150 mg/kg,其吸收明显减少,消除明显加快,且未能达到稳态浓度。4.大鼠口服DMY,血药浓度和体内过程特点个体差异大,且均与给药剂量有关,药物的吸收和消除均随剂量的增加而显著增加。5.大鼠口服DMY后,组织药物浓度低,且在肝、脑、肾分布有差异。6. Beagle犬大剂量单次或长期口服DMY后,其吸收量和消除均随剂量增加而显著增加。7.大鼠药代动力学和Beagle犬毒代动力学研究均表明,DMY的吸收速率与剂量没有明显相关性。