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犬细小病毒(canine parvovirus),与1967年发现的犬极小病毒(Minute virus of canine,又称作CPV-1)不同,为将两者加以区分,被命名为犬细小病毒2型(CPV-2)。CPV-2为DNA病毒,该病毒本身不带有聚合酶也不编码此类酶,必须利用细胞的DNA聚合酶II合成病毒DNA。试验证明该病毒复制能力有缺陷,体外培养传代时,必须在细胞培养同时或最迟在24 h内接种病毒方可达到病毒良好增殖目的。犬细小病毒病对于犬业的健康发展构成严重威胁,也有小熊猫感染CPV-2、大熊猫源犬细小病毒的报道;表明该病毒的易感宿主范围在扩大。犬细小病毒病的发病率和死亡率高、治愈率低,临床尚未研发出特效药,且由于当前使用的疫苗株可能与变异病毒株的氨基酸序列存在差异,增加了免疫失败及误诊的概率。早期确诊对于该病的预防及治疗意义重大,胶体金检测试纸条操作简便,检测结果直观,在宠物疾病检测方面应用广泛。目前市售胶体金检测试纸条主要是韩国安捷公司产品,该试纸条灵敏度好,特异性强,但其价格偏高,且制作工艺受专利保护。本研究旨在制备特异性好,亲和力高的CPV-2单克隆抗体,建立以此为基础的夹心ELISA及胶体金免疫层析检测方法,开发具有自主知识产权的检测试纸条。试验内容如下:试验1犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株制备采用猫肾细胞(FK81)扩增CPV-2,收集细胞培养物,蔗糖密度梯度离心法纯化病毒;经腹腔注射用纯化后病毒免疫5只BALB/c小鼠,将制备的脾细胞与生长状态良好的骨髓瘤细胞经PEG4000融合,经筛选及亚克隆,获得3株犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为1H3、2B5和1B1;分别对应的抗体亚类是IgG1κ、IgMκ和IgG1κ;3株单抗制备腹水的抗体效价依次为104、104和106;细胞培养上清效价分别为25、25和210。间接免疫荧光试验结果,3株单抗均可与CPV-2感染的FK81细胞特异性结合可观察到绿色荧光;采用固定病毒稀释血清法测定单抗腹水的中和效价,分别为1H3:102、2B5:102和1B1:106。试验2犬细小病毒单克隆抗体夹心ELISA检测法的建立犬细小病毒单克隆抗体1B1作为捕获抗体,1H3作为检测抗体,建立夹心ELISA检测方法,优化的检测条件为:1B1取2 μg/mL包被酶标板;封闭条件是含有5%脱脂奶粉的PBST(含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液)于37℃封闭2 h;抗原于37℃孵育1 h为最佳;检测抗体1:4000倍稀释进行反应。用所建ELISA法检测犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒1型(CAV-1)、犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV),结果均为阴性,表明本试验建立的犬细小病毒单克隆抗体夹心ELISA检测法具有良好的特异性。重复性试验表明,批内、批间变异系数均不超过10%;敏感性试验结果为,该法检测CPV-2含量至少为102 TCID50/mL。试验3犬细小病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条研制在上述所建CPV-2夹心检测法的基础上,建立胶体金免疫层析检测法并组装检测试纸条。将1H3包被于胶体金表面形成免疫胶体金,使两者最易形成牢固结合物的pH环境是7.0;检测抗体为1B1;质控线包被羊抗鼠IgG。各条件经优化试验证明,标记抗体1H3最终浓度为18μg/mL,1B1最佳包被浓度为1.5 mg/mL,羊抗鼠IgG浓度为1.0 mg/mL。组装的试纸条检测4种常见犬病毒病(CPIV、CAV-1、CDV、CCV),T线无颜色变化,说明试纸条的特异性好;同批次、不同批次制备的检测试纸条进行重复性试验,证明试纸条重复性良好。试纸条的敏感性是病毒含量为102 TCID50/mL时可检。使用此试纸条检测30份临床样品与PCR检测结果完全一致。本试验表明,所研制的胶体金检测试纸条可用于犬细小病毒病的临床检测。