随着肿瘤生物学的飞速发展，抗肿瘤药物的研发焦点已从传统的细胞毒类药物转向了靶向抗肿瘤药物。ras是一类重要的癌基因，与人类肿瘤相关的主要有三种：Harvey ras（H-ras）、Kirsten ras（K-ras）和Neuroblastoma ras（N-ras）。其中，K-ras与人类肿瘤的关系最为密切。研究表明，90%的胰腺癌患者均存在K-ras基因突变。ras基因突变后Ras蛋白持续激活，升高胞内Ras-GTP水平，并对抗GTP酶激活蛋白（GTPase activating protein，GAP）的负性调节，造成下游信号通路Raf-MEK-ERK的过度激活，从而导致细胞的过度增殖与肿瘤的发生。因此，针对Ras信号通路的肿瘤靶向治疗成为肿瘤靶向治疗学新的研究热点。Rasfonin是一种从真菌中分离获得的α-吡喃酮类化合物。初步研究发现，Rasfonin可选择性地抑制ras癌基因依赖小鼠B细胞系Ba/F3-V12细胞的存活，并可诱导细胞大量凋亡，而对ras基因非依赖的细胞系无明显影响，提示rasfonin可能具有抗ras基因突变肿瘤的作用。然而，由于rasfonin不论是提取还是化学合成均非常复杂，得率极低，因此，一直无法对其进行深入的药理学评价，限制了其进一步研究。本研究所车永胜教授课题组最近从青藏高原海拔4千米以上的土壤样品中分离到一种使发酵获取rasfonin效率大大提高的真菌Doratomyces sp.，目前使用该菌已分离获得数百毫克纯度＞98%的rasfonin，使得药理学研究成为可能。本课题对rasfonin的抗肿瘤活性进行了较为系统地评价并对其抗肿瘤机制进行了较为深入的探讨。一、Rasfonin体外抗肿瘤活性评价1. Rasfonin及其类似物体外对ras突变及非突变肿瘤细胞的选择性抑制作用为明确rasfonin对ras突变的肿瘤细胞的选择性，本研究选择了多种组织来源的ras突变肿瘤细胞系（结肠癌SW620细胞、胰腺癌Panc-1细胞、膀胱癌T24细胞）作为研究对象，并用ras非突变的相应肿瘤细胞（结肠癌Caco2细胞、胰腺癌BxPC-3细胞、乳腺癌MCF-7细胞）作为对照，观察了rasfonin及其类似物（A305、A306、A307等10个天然产物）对各种细胞存活的影响。结果表明，rasfonin、A305和A306对ras突变的肿瘤细胞均有选择抑制作用，其中rasfonin抑制ras突变肿瘤细胞存活的IC50为4.45-10.16μM，而在此浓度范围内对ras非突变的肿瘤细胞的存活无明显影响，提示rasfonin对ras突变的肿瘤细胞具有较高选择性。2. Rasfonin对ras突变及非突变胰腺癌细胞增殖的影响由于K-ras突变在胰腺癌中的比例为90%以上，我们选择了Panc-1（K-ras突变）和BxPC-3（野生型）两种胰腺癌细胞系，采用MTS法和xCELLigence实时细胞分析系统对细胞生长进行了观察。研究发现，rasfonin抑制Panc-1细胞增殖的起效浓度为5μM，而抑制BxPC-3细胞增殖的起效浓度为10μM。结果提示，rasfonin对ras突变的胰腺癌细胞增殖有一定的选择性抑制作用。3. Rasfonin对ras突变肿瘤细胞克隆形成的影响克隆形成表示细胞的独立生存能力，它反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。容易形成克隆的肿瘤细胞独立生存能力和增殖能力强，因此通过克隆形成实验能较灵敏地测定抗肿瘤药的活性。K-ras基因突变的Panc-1和SW620细胞体外培养较非突变BxPC-3细胞更易形成克隆，因此，本研究选取Panc-1和SW620细胞，进一步观察rasfonin对克隆形成能力的影响。结果表明，rasfonin在0.25-1μM浓度范围内能显著抑制Panc-1和SW620细胞的克隆形成，具有明显的浓度依赖性。当rasfonin浓度达到5μM时，Panc-1细胞和SW620细胞已无法形成克隆，表明rasfonin对两种K-ras突变肿瘤细胞的独立生存和增殖能力具有明显的抑制作用。4. Rasfonin对ras突变胰腺癌Panc-1细胞迁移和侵袭能力的影响肿瘤细胞的迁移和侵袭活性决定肿瘤的发生发展及恶性程度，迁移和侵袭能力强的肿瘤细胞恶性程度强，迁移和侵袭能力弱的肿瘤细胞恶性程度低。本研究采用xCELLigence实时细胞分析系统观察了Rasfonin对Panc-1细胞迁移和侵袭能力的影响。结果表明，K-ras突变的Panc-1细胞具有明显的迁移和侵袭能力，而K-ras非突变的BxPC-3细胞不发生迁移和侵袭。阳性对照药Salirasi（bFTS）（50μM）显著抑制Panc-1细胞的迁移和侵袭，Rasfonin（1-15μM）亦可浓度依赖性抑制Panc-1细胞的迁移和侵袭能力。5. Rasfonin对ras突变胰腺癌Panc-1细胞早期凋亡的影响本研究采用流式细胞术，以Annexin-V为荧光探针，观察了rasfonin对Panc-1细胞凋亡的影响。结果表明，1-5μM rasfonin处理细胞24h，Panc-1细胞的早期凋亡率无明显变化，而rasfonin浓度达到10μM时，Panc-1细胞的早期凋亡率明显上升（20.34%），但显著低于阳性对照星形孢菌素组（31.86%）。综上所述，rasfonin对K-ras突变Panc-1细胞的增殖能力、独立生存能力、迁移和侵袭能力均有显著的抑制作用，而对该细胞的早期凋亡无明显影响。二、Rasfonin体内抗肿瘤活性评价进而，本研究在整体动物上选用胰腺癌Panc-1小鼠移植瘤模型对rasfonin的体内抗肿瘤活性进行了评价。Panc-1细胞接种1w后（d0），根据移植瘤大小将小鼠随机分为5组，即模型组，阳性药FTS15mg/kg治疗组，rasfonin三个剂量（7.5、15和30mg/kg）治疗组。Rasfonin腹腔注射给药，隔天1次，连续20天（d20）。动态监测肿瘤体积发现，模型组自d10开始，肿瘤体积增长迅速。在d20时，平均肿瘤体积达到1000mm3。而FTS15mg/kg治疗组与rasfonin30mg/kg治疗组自d10开始可以显著降低肿瘤体积；d20时，rasfonin30mg/kg治疗组相对肿瘤体积低于FTS15mg/kg治疗组。实验结束后，取肿瘤称重，与模型组相比，rasfonin15和30mg/kg剂量组瘤重显著降低，抑瘤率分别为54.3%和61.2%。实验中未观察到FTS和rasfonin引起小鼠体重下降，但实验结束后发现rasfonin30mg/kg组脾脏系数显著降低，余脏器系数无明显变化，提示rasfonin可能具有免疫抑制作用。血常规检测结果表明，FTS和rasfonin对血液中红细胞数和血红蛋白含量无明显影响，但可显著增加血小板的含量，具体原因有待探明。综上，本研究成功建立了人胰腺癌Panc-1裸鼠异体移植瘤模型，rasfonin能够显著抑制裸鼠Panc-1异体移植瘤的生长。三、Rasfonin的作用机理研究在确定rasfonin抗ras突变肿瘤的基础上，本研究从Ras蛋白及其信号通路关键1. Rasfonin对Panc-1细胞中Ras蛋白表达和活性的影响采用western blotting法检测了rasfonin对Ras蛋白表达的影响，结果表明，rasfonin在1-10μM浓度范围内对Panc-1细胞Ras蛋白的表达无明显影响。进而，采用pull down实验检测rasfonin对Ras蛋白活性的影响，结果表明，rasfonin在1-10μM浓度范围内可浓度依赖性地降低表皮生长因子（EGF）所致Panc-1细胞Ras蛋白的活性，FTS具有相同的作用，提示rasfonin抗肿瘤活性可能与降低Ras蛋白的活性有关。2. Rasfonin对Panc-1细胞Ras-MAPK下游蛋白激酶的影响活化的Ras与GTP结合从而激活Ras-Raf-MAPK信号通路调控细胞增殖和生存。为明确rasfonin对Ras-MAPK下游蛋白激酶的影响，进一步检测了Ras信号通路的下游蛋白激酶的表达。结果表明，FTS和rasfonin均可显著降低EGF所致下游Raf，MEK和ERK磷酸化水平的升高，即降低p-c-Raf、p-MEK1/2和p-ERK44/42的水平，而对非磷酸化的MEK1/2、ERK44/42水平无明显影响。该结果进一步提示了rasfonin可以通过降低Ras蛋白的活性进而影响其下游蛋白激酶的磷酸化。3. Rasfonin对Panc-1细胞Ras-MAPK上游相关蛋白的影响为明确rasfonin降低Ras蛋白活性的作用靶点，本研究观察了其对Ras-MAPK上游信号分子的作用。首先观察了对Ras-MAPK上游相关蛋白表达的影响，如生长因子受体结合蛋白（GRB2）、鸟苷酸交换因子GEF（Sos1）和GTP酶激活蛋白（GAP）等，结果表明，rasfonin和FTS对Panc-1细胞GRB2和GAP表达无明显影响，但能显著降低Sos1的水平。进而采用放射性同位素标记实验，考察了rasfonin对Sos1和GAP活性的影响，结果表明，rasfonin对Sos1催化RasGDP复合体解离，以及GAP催化生成RasGDP复合体均无显著影响，提示rasfonin对Sos1和RasGAP活性无明显影响。以上结果提示rasfonin降低Ras蛋白的活性可能与其降低Sos1的表达有关。4. Rasfonin对EGFR家族多种蛋白激酶活性的影响此外，本研究在分子水平考察了rasfonin对EGFR信号通路中包括Ras信号通路相关激酶在内的多种激酶活性的影响，旨在进一步明确rasfonin对蛋白激酶的选择性。采用放射性配体标记实验，检测了rasfonin对19种EGFR家族蛋白激酶活性的影响（EGFR、FGFR、PDGFRα、PDGFRβ、Flt3、Met、FAK、c-RAF、MEK1、PI3Kinase、PKBα、PKBβ、PKBγ、IKKα、mTOR、p70S6K、JNK1α1、JNK2α2、Ros）。结果表明，rasfonin对其中绝大多种激酶活性无明显影响，仅对mTOR（Ras下游信号之一）下游的p70S6K活性有上调的作用。此结果进一步证实，rasfonin的作用靶点极可能在Ras信号通路上。综上，rasfonin的抗肿瘤作用机理之一可能是通过下调Sos1蛋白表达抑制Ras蛋白的活化，进而影响其下游MAPK蛋白的磷酸化。通过以上研究，本论文主要得出以下结论：1. Rasfonin对多种组织来源的ras突变的肿瘤细胞具有选择性抑制作用。2. Rasfonin能够浓度依赖性地抑制K-ras突变的人源胰腺癌Panc-1细胞和人源结肠癌SW620细胞的克隆形成。3. Rasfonin能够浓度依赖性地抑制人胰腺癌Panc-1细胞的迁移和侵袭，但对其早期凋亡无明显诱导作用。4. Rasfonin能够剂量依赖性地抑制人胰腺癌Panc-1裸鼠异体移植瘤的生长。5. Rasfonin的抗肿瘤作用机理之一可能是通过下调Sos1蛋白表达而抑制Ras蛋白的活化，进一步影响其下游MAPK蛋白的磷酸化。总之，本研究首次对rasfonin进行了系统的药理学评价，发现rasfonin对ras突变的肿瘤细胞及裸鼠移植瘤具有较强的抗肿瘤作用，并首次发现下调Sos1蛋白表达、抑制Ras蛋白的活化，进而抑制其下游MAPK蛋白的磷酸化可能是rasfonin抗肿瘤作用的机制之一。