论文部分内容阅读
目的：构建针对Her2/neu的RNA干扰慢病毒载体，通过体内、外实验观察HER2表达受抑制后对卵巢癌细胞SKOV-3生物学行为的影响，并利用放射性核素131I标记针对HER2的单抗Herceptin，SPECT显像活体监测转导HER2-siRNA后的干扰效应，初步探索SPECT在RNAi生物治疗中的应用前景。方法：①根据Her2/neu基因的cDNA序列，设计、构建及鉴定三条特异性的HER2-siRNA慢病毒表达载体及一条随机序列的阴性对照慢病毒表达载体。②将上述载体经Lipofectamine2000转染到293T细胞中，收获病毒上清液感染人卵巢癌细胞株SKOV-3，通过RT-PCR筛选出干扰效率最高的重组慢病毒表达载体。③建立稳定表达有效HER2干扰序列的SKOV-3细胞株及阴性对照细胞株，组成KD1组和NC组，并以未感染的SKOV-3细胞作为CON组，分别通过流式细胞仪、Western blot及MTT法检测各实验组细胞HER2的表达、细胞凋亡及增殖；④将各实验组细胞接种裸鼠，检测成瘤率、成瘤时间、瘤体大小；免疫组化测定各实验组HER2蛋白表达，并通过SPECT行131I-Herceptin显像，计算各实验组肿瘤/本底（T/B）比值。结果：①成功构建三条HER2-siRNA干扰序列重组慢病毒表达载体及阴性对照慢病毒表达载体，测序证实序列正确。②重组慢病毒表达载体感染293T细胞后，成功获得了高滴度的病毒液。感染靶细胞后，通过RT-PCR筛选出干扰效率最高的序列HER2/siRNA-1，其HER2mRNA抑制率为82.7%。③经嘌呤霉素筛选获得稳定表达有效干扰序列和阴性对照序列的实验细胞株。流式细胞仪测得KD1组、NC组和CON组的HER2蛋白表达率分别为（48.10±3.19）%、（88.33±2.08）%和（90.42±2.66）%，KD1组与NC和CON组比较有显著差异（P＜0.05），其HER2蛋白的抑制率达（53.22±0.04）%；KD1组细胞早期凋亡为（15.42±0.38）%，与NC组（5.98±0.16）%及CON组（5.33±0.08）%比较，差异有显著性（P＜0.01）；Western blot显示KD1组HER2蛋白相对表达量为（0.545±0.130），明显低于NC（1.315±0.023）和CON组（1.291±0.025）；MTT检测结果显示KD1组细胞增殖较NC和CON组明显减缓（P＜0.01）；④体内实验结果显示KD1组移植瘤相比NC和CON组，平均成瘤时间延迟，平均瘤体积、瘤体重量明显减小（P＜0.05）；免疫组化结果进一步证实KD1组HER2蛋白表达明显下调；裸鼠经尾静脉注射131I-Herceptin后1h即可见移植瘤部位显影，随时间延长，放射性逐渐浓聚，瘤体显影清晰；比较各时间点T/B值，KD1组与NC和CON组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：针对Her2/neu的siRNA慢病毒载体可以显著抑制靶基因的表达，使卵巢癌SKOV3细胞的生物学行为明显受抑。利用131I-Herceptin进行SPECT分子显像对SKOV-3移植瘤显影清晰，T/B比值一定程度上能够反映HER2蛋白的表达情况，有望用于针对HER2靶点的RNA干扰治疗中活体疗效评估。