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本次研究拟在前期对花色苷生物学作用研究的基础上，采用大鼠成熟原代脂肪细胞为模型，选用花色苷中常见的矢车菊素-3-葡萄糖苷作为受试物，观察花色苷在体外对大鼠原代脂肪细胞AMPK活化、脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影响，以及在体内对AMPK以及其下游酶类活化的影响，明确花色苷是否能够通过AMPK信号通路调节脂肪积聚。
研究目的：
1观察花色苷在体外对原代脂肪细胞脂肪酸氧化和甘油三酯含量的影响，探讨AMPK信号通路调节脂肪积聚的机制；
2观察花色苷在体内对脂肪细胞的作用，探讨与AMPK通路的相关机制，以及花色苷的抗肥胖作用，为营养膳食防治肥胖提供理论依据。
研究方法：
1.细胞实验
1.1.大鼠原代成熟脂肪细胞模型的建立
SD大鼠断头处死，浸于75％酒精中消毒。
大鼠成熟脂肪细胞的鉴定：进行油红O-苏木精染色后显微镜下观察，细胞内有大量脂滴存在，呈红色，细胞核呈蓝色，符合脂肪细胞形态特点。
1.2.细胞培养及分组
取出的大鼠成熟原代脂肪细胞分别用1μM、10μM、100μM Cy-3-g处理1h；用不加任何干预的细胞作为对照(control)，用1mM的AMPK激动剂AICAR作为阳性对照。
1.3.花色苷Cy-3-g对大鼠脂肪细胞甘油三酯(Triglyceride，TG)含量的影响
将大鼠原代脂肪细胞分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集细胞用试剂盒检测。
1.4.花色苷Cy-3-g对大鼠脂肪细胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，FAO)的影响
将脂肪细胞在无血清DMEM培养基中饥饿6～8h，用1μM、10μM、100μM的花色苷干预1h，每孔加入3H-棕榈酸2μCi/mL、L-卡尼丁(L-camitine)1mmol/L，孵育后吸弃培养基，测定3H2O放射性。
1.5花色苷Cy-3-g对大鼠脂肪细胞CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影响
将脂肪细胞饥饿6～8h后，分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mMAICAR孵育1h，收集细胞总蛋白用于免疫印迹检测。
1.6花色苷Cy-3-g对大鼠脂肪细胞内AMPK活性的影响
将饥饿后的脂肪细胞分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集细胞，用AMPK试剂盒检测AMPK活性。
1.7花色苷Cy-3-g对大鼠脂肪细胞内AMPK及其磷酸化水平的影响
将饥饿后的脂肪细胞分别与1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集细胞总蛋白用于免疫印记检测。
2.动物实验
2.1 Kkay小鼠的喂养
在自然光照(08：00到20：00)和23±3℃的条件下喂养Kkay小鼠。把5周龄的Kkay小鼠随机分为2组，每组6只小鼠。其中1组用添加花色苷Cy-3-g(1g/kg)的饲料喂养，另外一组用标准饲料喂养。
2.2花色苷对Kkay小鼠体重、摄食量和腹部脂肪的影响
喂养8周后，处死小鼠，取腹部脂肪组织，称量重量。称量Kkay小鼠的5周龄时的开始体重与花色苷喂养8周后的终体重，并计算出8周内Kkay小鼠的摄食量。
2.3花色苷Cy-3-g对小鼠腹部脂肪组织内CPT-Ⅰ水平和ACC磷酸化的影响
取花色甘组和对照组Kkay小鼠的腹部脂肪组织，裂解组织后，收集细胞总蛋白用于免疫印迹检测。
2.4花色苷Cy-3-g对小鼠腹部脂肪组织内AMPK活性的影响
取花色甘组和对照组Kkay小鼠的腹部脂肪组织，裂解组织后，收集组织中总蛋白用于AMPK活性的检测。
2.5花色苷Cy-3-g对大鼠脂肪细胞内AMPK及其磷酸化水平的影响
取花色甘组和对照组Kkay小鼠的腹部脂肪组织，裂解组织后，收集细胞总蛋白用于免疫印迹检测。
2.6花色苷Cy-3-g对小鼠腹部脂肪组织形态的影响
8周后处死花色苷组和对照组的Kkay小鼠，取腹部脂肪组织，进行石蜡切片HE染色。
研究结果：
1细胞实验
1.1花色苷对大鼠脂肪细胞甘油三酯含量的影响
与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能显著减少脂肪细胞内的甘油三酯含量(p＜0.001)，甘油三酯含量分别减少了27.9％、30.5％、45.7％，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，分别相当于1mMAICAR处理组的39.4％、43.0％和64.5％。
1.2花色苷对大鼠脂肪细胞脂肪酸氧化的影响
与对照组相比，100μM Cy-3-g能显著促进脂肪细胞脂肪酸氧化(p＜0.001)，而1μM、10μM Cy-3-g在促进脂肪细胞脂肪酸氧化上没有统计学意义。Cy-3-g浓度从低到高其脂肪酸氧化水平分别为对照组的1.42、1.44、2.15倍。AMPK激动剂1mMAICAR处理组为对照组的2.48倍。与AICAR相比，分别相当于1mMAICAR处理组的56.7％、58.1％和86.8％。
1.3花色苷对大鼠脂肪细胞CPT-Ⅰ蛋白表达的影响
与对照组相比，10μM、100μM Cy-3-g能显著促进脂肪细胞内CPT-Ⅰ蛋白的表达水平(p＜0.01)，CPT-Ⅰ蛋白表达水平分别为对照组的2.1倍和2.3倍，呈明显的剂量-效应关系。1μM的Cy-3-g处理组CPT-Ⅰ蛋白表达水平为对照组的1.5倍，没有统计学意义。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mM AICAR处理组的53.5％、76.2％和84.5％。
1.4花色苷对大鼠脂肪细胞ACC磷酸化的影响
与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能显著促进脂肪细胞内ACC的磷酸化(p＜0.001)，ACC磷酸化分别为对照组的1.3、1.5和1.6倍，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mMAICAR处理组的69.0％、80.5％和85.3％。
1.5花色苷对大鼠脂肪细胞AMPK活化的影响
与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能显著促进脂肪细胞内AMPK的活性(p＜0.001)，AMPK蛋白活性分别为对照组的1.35、1.39和1.49倍，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mM AICAR处理组的72.5％、77.3％和82.6％。
1.6花色苷对大鼠脂肪细胞AMPK磷酸化的影响
与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能使显著促进脂肪细胞内AMPK蛋白磷酸化(p＜0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平分别为对照组的2.2、2.6和2.7倍，呈明显的剂量-效应关系。与AMPK激动剂AICAR相比，相当于1mMAICAR处理组的71.2％、83.9％和88.5％。
1.7花色苷对大鼠脂肪细胞AMPK蛋白的影响
与对照组相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR对AMPK蛋白表达水平无影响(p＞0.05)。
2动物实验
2.1花色苷对Kkay小鼠体重、摄食量和腹部脂肪的影响
花色苷喂养的Kkay小鼠和对照组相比，体重、摄食量以及腹部脂肪组织重量都没有明显差异(p＞0.05)，没有统计学意义。
2.2花色苷对小鼠腹部脂肪组织内AMPK活化的影响
与一般饲料喂养的对照组相比，花色苷喂养组小鼠的组织中AMPK的活性明显升高(p＜0.001)，AMPK的活性为对照组的3.8倍，有明显统计学意义。
2.3花色苷对小鼠腹部脂肪组织内AMPK磷酸化的影响
与一般饲料喂养的对照组相比，花色苷喂养组小鼠的组织中AMPK磷酸的水平明显升高(p＜0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平为对照组的6.2倍，有明显统计学意义。
2.4花色苷对小鼠腹部脂肪组织内AMPK蛋白表达的影响
与一般饲料喂养的对照组相比，花色苷喂养组小鼠的组织中AMPK表达水平没有明显变化(p＞0.05)，没有统计学意义。
2.5花色苷对小鼠腹部脂肪组织内ACC磷酸化的影响
与一般饲料喂养的对照组相比，花色苷喂养组小鼠的组织中ACC磷酸的水平明显升高(p＜0.001)，ACC蛋白磷酸化水平为对照组的4.4倍，有统计学意义。
2.6花色苷对小鼠腹部脂肪组织内CPT-Ⅰ蛋白表达的影响
与一般饲料喂养的对照组相比，花色苷喂养组小鼠的组织中CPT-1的表达水平明显升高(p＜0.001)，CPT-1蛋白的表达水平为对照组的4.1倍，有明显统计学意义。
2.7花色苷对小鼠腹部脂肪组织形态的影响
在显微镜下可见，与花色苷喂养组相比较，一般饲料喂养的对照组的腹部脂肪细胞明显肥大。花色苷喂养的Kkay小鼠的脂肪细胞体积更小，排列更整齐。
结论：
1.花色苷Cy-3-g可以减少大鼠原代脂肪细胞脂肪积聚，其机制可能与调节脂肪细胞AMPK-ACC-CPT-Ⅰ信号通路，促进脂肪酸氧化有关。
2.花色苷Cy-3-g可以在Kkay小鼠体内激活AMPK信号通路，并能减少脂肪细胞体积。