目的：1．研究细胞周期正调控因子p27KipI的磷酸化在肝细胞肝癌中的表达与临床病理和预后的关系，初步探讨p27Kip1的磷酸化在肝细胞肝癌中的重要意义；
　　 2．研究PI3K抑制剂LY294002对肝癌细胞活性、细胞周期及细胞凋亡的影响，初步探讨p27Kip1在此过程中的作用机制；
　　 3．构建pEGFP-p27wt和pEGFP-p27Kipl(T198A)突变质粒，为下一步转染HCC细胞株分析突变后对p27kip1的降解、亚细胞定位及生物学功能的影响奠定了实验基础。
　　 方法：
　　 1．我们研究p27Kip1的157号位苏氨酸磷酸化在肝细胞肝癌中的表达，对51例肝癌组织石蜡切片进行免疫组织化学分析和对8例新鲜冰冻组织进行Westernblot分析。检测p-p27kip1Thr157与肝细胞肝癌的临床病理及其预后之间的关系。然后进一步观察p27IKip1的198号位苏氨酸磷酸化在肝细胞肝癌中的表达情况。
　　 2．我们运用CCK-8和流式细胞仪检测肝癌细胞用PI3K抑制剂LY294002处理后的增值和细胞周期的变化：Westernblot分析p27Kip1表达变化和定位情况。
　　 3．人类野生型p27Kip1是通过寡核苷酸引物(5CGAGATCTGATGTCAAACGTGCGAGT3’和5CTGAATTCTTGACGTCTTCTGAGGCC3’)PCR扩增，然后克隆到质粒pEGFP-N2的BglⅡ-EcoRI位点，产生pEGFP-p27Kip1wt载体。而p27kip1的198号位苏氨酸突变为丙氨酸p27Kip1(T198A)是运用重叠（序列）延伸PCR技术使突变位点转到野生型的p27kip1上，其引物是5CTCTCGAGGATGTCAAACGTGCGAGT3and5CGGAATTCTTTGACGTCTTCTGAGGCC3’。pEGFP-p27wt和pEGFP-p27Kip1(T198A)都被插入载体pcDNA3.1/myc-His的XhoI/EcoRI位点。最后测序确定质粒克隆的准确性。
　　 结果：
　　 1.51例免疫组化分析发现p-p27kip1Thr157和KI67的表达呈正相关(r=0.161；p<0.05);p-p27kip1Thr157是与肝癌患者肿瘤病理分级相关的(P=0.043)，而Ki67的表达强度与患者血清AFP水平、坏死程度、肿瘤病理分级以及转移相关，P值分别为0.035、0.040、0.004、0.049。Kaplan-Meier分析发现p-p27kip1Thr157和KI67的表达与肝癌患者的预后相关。进一步观察到p-p27kip1Thr198在HCC中高表达，表达在细胞核和（或）胞浆中，p-p27kip1Thr198在非癌组织中几乎无表达。
　　 2．本研究中PI3K抑制剂LY294002明显地抑制肝癌细胞的增殖，而且呈剂量依赖性，这个过程是通过p27来实现的，而p21，p16等其它抑癌因子在此过程中没有表达变化；同时核浆分离Westernblot检测p27在核内聚集。
　　 3．成功得构建pEGFP-p27wt和pEGFP-p27Kip1(T198A)质粒。
　　 结论：
　　 1．P-p27kip1Thr157可能是肝细胞肝癌的重要的预后指标。
　　 2．在临床上PI3K抑制剂LY294002可能可以作为肝癌化疗的一种药物；PI3K抑制剂LY294002发挥抑制增殖的作用可能是通过调控p27kiP1表达和定位来实现的。