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本文以一株能在胞外大量积累L-山梨糖的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans WSH-003)为出发菌株，以细胞固定化条件及与L-山梨糖合成密切相关的D-山梨醇代谢途径为研究对象，结合发酵工程手段建立半连续发酵策略，利用代谢工程手段强化D-山梨醇氧化脱氢途径构建得到一株重组菌，并将重组菌应用于半连续发酵策略促进L-山梨糖的连续高效积累。本论文主要研究成果如下：(1)在详细考察几种常见的固定化材料的基础上，研究了不同载体材料及浓度、固定化条件、固定化细胞直径对D-山梨醇转化率的影响。结果表明，以海藻酸钠(25g L-1)为载体，CaCl2(15g L-1)为成型剂，添加硅藻土(5g L-1)作为辅助剂，4℃静置3h，固定化细胞直径为2mm时，L-山梨糖的生产效率最高，发酵36h后转化率可达93.5%。此条件下获得的固定化细胞发酵性能稳定，可重复使用15d以上，在10批次的重复发酵中前九批转化率均在80%以上。(2)建立半连续发酵策略，提高L-山梨糖生产效率。在详细考察固定化细胞于1-L发酵罐条件下发酵特性的基础上，设计了间歇流加和匀速流加两种补料策略，研究不同的补料方式对L-山梨糖发酵的影响。研究表明，间歇流加更有利于L-山梨糖的积累。此外，通过对L-山梨糖发酵过程中D-山梨醇消耗数据进行线性拟合，得到了L-山梨糖发酵过程中底物消耗的动力学方程，并以此为依据建立了半连续发酵策略。总共进行了21批次的补料发酵，结果发现前20批次流加中，D-山梨醇的转化率均达90%以上。(3)强化D-山梨醇氧化途径，促进L-山梨糖的快速生成。通过自克隆的方法，将来源于G. oxydans WSH-003自身的山梨醇脱氢酶基因(sldhAB)及其启动子(tufB)克隆获得多拷贝，并通过在sldhAB基因终止密码子后连接不同的poly(A/T)尾巴以增强其mRNA的稳定性，进而强化这一途径。结果表明，构建得到的一株名为G. oxydans SLDH6的重组菌其sldhAB的表达量和野生菌相比上调了6.2倍，和G. oxydans SLDH(过量表达sldhAB，但不带poly(A/T)尾巴)相比上调了1.7倍。在1-L发酵罐条件下，重组菌G. oxydansSLDH6发酵16h后L-山梨糖已经达到最大累积量，是野生菌的1.4倍。将固定化重组菌G. oxydans SLDH6应用于半连续发酵策略，与固定化野生菌相比L-山梨糖净累积量增加了33.7%。