血管移植手术是治疗心血管疾病的主要手段。自体血管和人工合成血管是临床上常用的血管移植物,但自体血管来源有限,难以满足临床需求。人工合成血管如涤纶(Dacron)和膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)在大直径血管(内径>6mm)移植中有较佳的效果,但在小直径血管(内径<6mm)移植中容易出现形成血栓、内膜增生、血管狭窄甚至阻塞等现象。组织工程血管技术为小直径血管移植物提供了新来源。目前小直径组织工程血管的构建的方法包括体内构建和体外构建：体外构建包括诱导分化、细胞种植和体内移植三个过程；体内构建是将复合有种子细胞的血管支架移植到动物体内血管缺损部位,借助动态血流环境和体内刺激构建组织工程血管。基于这两种方法构建的组织工程血管已有报道,但是尚未有能应用于临床。分析认为存在以下问题：血管支架的生物学性能和力学性能不足；血管支架不具有多层次结构,不能为不同的血管细胞提供合适的微环境；应用的种子细胞传代次数有限,增殖能力不强,基质分泌受限,无法形成有效的组织工程血管；静态培养构建的组织工程血管在力学性能和生理功能方面与天然血管存在差异。针对这些问题,本研究结合前期的工作基础,采用集成的解决办法,提出本研究思路：模拟血管多层结构,应用静电纺丝工艺,共混RGD-重组蛛丝蛋白(pNSR16)、聚己内酯(PCL)、壳聚糖(CS)和明胶(Gt),构建(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)双层蛛丝蛋白血管支架,结合支架的降解性质、生物力学性能、血液相容性和生物安全性的研究,全面评价血管支架的材料与生物学性能。优化SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离及其分化为内皮细胞的方法,研究其生物学特性,探讨信号通路在血管支架与干细胞相互作用过程中的作用机制。模拟动物体内的动态血流环境,将间充质干细胞与血管支架复合动态培养,在体外培养构建形成类似天然血管的组织工程血管。将制备的小直径组织工程血管修复SD大鼠血管缺损,考察其移植体内后结构稳定性及血流通畅性,分析其修复血管的能力,为其临床应用奠定基础。研究结果如下：一、应用静电纺丝技术制备双层蛛丝蛋白血管支架,并对其进行理化性能的表征。同时制备了脱细胞血管支架作为性能评价的参照物,其管壁的弹性良好,管腔内表面光滑。扫描电镜观察显示双层蛛丝蛋白血管支架微观结构为纳米级纤维彼此交错排列形成的三维多孔网状；接触角仅为47度,亲水性能优良；X射线光电子能谱(XPS)研究表明其光谱区域出现了P2p (134.57eV)信号,证实pNSR16整合进了血管支架中；其具有较强的抗热性能,优于脱细胞血管支架；玻璃化转变温度为32.01℃-44.43℃；经105℃高温处理3小时后,其水分丧失率为11.2%,高于脱细胞血管支架。二、探讨双层蛛丝蛋白血管支架的生物力学性能与降解性能。其爆破强度、拉伸强度和缝合强度大小均与质量分数和管壁厚度成正比,孔隙率、水渗透性和断裂伸长率大小与质量分数和管壁厚度成反比。爆破强度的范围为39kPa-150kPa,高于生理血压；缝合强度大于0.19N,满足体内移植的要求；拉伸强度高于人体桡动脉血管,满足体内移植的要求；水渗透性为0.3-06mL· min-1·cm-2。体外降解结果表明：其降解程度深于同等条件下的(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,血管支架在酶解液中的降解程度均高于在PBS中的降解；吸水率在12周时达到80%-90%,高于对照组；在降解液处理期间,其降解液pH值较为平稳,(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架降解液pH值下降趋势明显；其初始抗弯强度和初始分子量大于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,前者抗弯强度和分子量下降较快,而后者的抗压强度下降较缓慢。体内降解结果表明：血管支架在整个植入期内不断降解,(pNSR.16/PCL/CS)/(pNSRl6/PCL/Gt)支架降解程度更深,纤维断裂严重,12周时失重率为20.3%,其降解速度明显快于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,后者在12周时仅降解了13.2%。三、评价双层蛛丝蛋白血管支架的生物安全性与血液相容性。在血管支架浸提液培养条件下的间充质干细胞呈现梭形,团聚式增殖。大鼠腹腔注射血管支架生理盐水浸提液,7天内实验组大鼠全部存活,与对照组比较,外观未见异常改变,脏器指数在统计学上无显著性差异。皮肤刺激试验结果表明,实验组大鼠平均记分在0-0.4范围内,无红斑、水肿形成,属于极轻微刺激反应类型,HE染色表明无炎症出现。在敷贴试验中实验组大鼠皮肤无明显变化,无红斑和水肿,平均反应等级都为0。彗星电泳试验表明血管支架浸提液不会对细胞造成DNA损伤,细胞核完整。注射血管支架浸提液的SD大鼠的体温升高值低于0.2℃,表明浸提液不含致热源物质,植入动物体内后其无热源作用。经支架浸提液处理的间充质干细胞的染色体畸变率均<5%,符合生物安全要求。注射血管支架浸提液后,昆明小鼠PCE的微核率为3.1±1.5‰,无致畸性,表明支架浸提液不会造成细胞DNA损伤。血管支架的溶血率仅为1.5%,符合IS010993小于5%的要求；复钙化凝血时间和动态凝血时间实验结果证实其具有良好的抗凝血性能,且与(PCL/CS)/(PCL/Gt)相比在统计学上具有显著性差异；血管支架上黏附的血小板极少,P-选择素表达量仅为0.389,其吸附蛋白的量明显低于(PCL/CS)/(PCL/Gt)。在浸入新鲜血液中后,12h内血管支架管腔持续通畅,无血栓出现。对血管支架进行生理盐水溶液浸提,在浸提25d内,其抗凝血性能始终良好。作为血管组织工程支架材料,双层蛛丝蛋白血管支架具有良好的血液相容性。四、优化SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)分离及向内皮细胞分化的方法,研究干细胞的生物学特性。MSc多呈梭形和星形,细胞形态均一,细胞生长旺盛。分离自骨髓的MSC的CD105和CD90因子的表达率分别为82.54%和94.98%,而CD45因子的表达率仅为7.32%。第4代MSC多呈梭形,细胞呈团聚分布,增殖能力强,增殖指数达到20.31%,潜伏期短,自第2天就进入对数生长期；第8代MSC的增殖能力显著减弱,增殖指数仅为9.24%,细胞形状呈现不规则状,胞体变大,有老化现象。第2代和第4代MSC冻存复苏后的存活率均高于80%,第8代MSC的存活率大约为60%。MSC在诱导5d时CD31即有较弱表达,随着诱导时间的延长,表达随之增强。诱导10天后,所有代数的MSc均表达CD31,但是第2代、第4代和第6代MSC表达CD31的阳性率与第8代相比有差异。在4h时,不同代数的MSC在双层蛛丝蛋白血管支架上有了不同程度的黏附,第6代之前的干细胞的黏附率皆在40%左右,然而第8代干细胞的黏附率为27%。五、评价双层蛛丝蛋白血管支架的细胞相容性与组织相容性,探讨信号通路在血管支架与干细胞相互作用过程中的作用机制。在血管支架浸提液培养条件下的大鼠骨髓MSC集落生成率、平均集落面积和分裂指数都显著高于对照组。血管支架毒性等级均低于1级,无细胞毒性。与血管支架浸提液复合培养的MSC生长状态良好,台盼蓝拒染率高于95%,复合培养48h后,细胞G0/1期比例降低,S、G2/M期比例均升高。MSC在血管支架上能良好地黏附生长,增殖旺盛,能够迁移到血管支架内部。Notch信号通路对干细胞在双层蛛丝蛋白血管支架上的增殖起着重要的作用,pNSR16与Notch信号通路有相互作用关系,pNSR16有可能是Notch受体的配体结构类似物,起着配体作用。而不含有RGD三肽的胶原蛋白与Notch信号通路无相互作用关系,由此认为pNSRl6中的RGD序列能有效促进细胞的增殖。与血管支架复合培养的MSC中Notch信号通路下游基因Hesl的表达量高于对照组,且第6代MSCHesl基因表达比值低于第4代。血管支架皮下植入2周后,血管支架上的炎性细胞数量少于对照组,不会诱发严重的炎症反应。双层蛛丝蛋白血管支架的组织相容性优于(PCL/CS)/(PCL/Gt)支架,且前者的降解速度快于后者。六、应用动态培养的方法将间充质干细胞和双层蛛丝蛋白血管支架复合培养构建小直径组织工程血管。培养7天后,细胞和支架表面结合紧密,细胞在纳米纤维支架上充分铺展,并且可以迁移到血管支架纤维内部生长,细胞与血管支架纤维表现出很好的相容性,与材料融合成为三维细胞网状结构,且将材料纤维大部分包埋,形成了组织工程血管。组织工程血管的缝合强度为0.95±0.12N,是天然血管的29.6%。随着时间的持续,组织工程血管中的羟脯氨酸含量和DNA含量不断增加,羟脯氨酸含量在第14天和第28天分别达到0.16ug/mg和0.2ug/mg,且与对照组相比在统计学上有显著性差异。七、探讨组织工程血管修复SD大鼠腹主动脉缺损的效果。在移植手术期间,重新恢复血流时组织工程血管以及吻合口均未出现渗血漏血现象,置换后可观察到血管搏动良好。术后动物恢复良好,未见发炎现象。体重为350-450g的SD大鼠腹动脉管径与人体主要冠状动脉(LAD中远段)相比无明显差别。经血液生理生化指标分析,证实该组织工程血管对肝肾无明显毒性作用。在移植体内12周后组织工程血管的断裂强度为3.4MPa,相对于移植前的强度(6.1MPa)有所降低,但仍然高于天然血管的断裂强度,说明小直径组织工程血管在体内组织液环境中能保持一定程度的力学强度。在12周的移植期内胶原蛋白的合成与分泌不断增加,羟脯氨酸的相对含量在2周时约为12.5%,在12周时增加到46.7%。12周后移植血管内壁覆盖有较多的细胞。结论：本研究成功构建了双层蛛丝蛋白血管支架,其具有良好的抗热性、亲水性、血液相容性、生物力学性能、适宜的降解性能和生物安全性。优化了大鼠骨髓MSC的分离方法,分离的MSC增殖性良好,在体外培养条件下不同代数的MSC的生物学性能有一定的差异。MSC与双层蛛丝蛋白血管支架的细胞相容性良好,蛛丝蛋白可能是与Notch信号通路的Notch受体相互作用,促进下游基因Hesl的表达,促进细胞的增殖。应用动态培养的方式构建了小直径组织工程血管,并应用于SD大鼠腹主动脉的缺损修复,12周的移植期内无血栓,大鼠身体状况良好,表明小直径组织工程血管应用于临床具有一定的可行性。