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转基因沉默(Transgenic Silencing)现象普遍存在于转基因动植物上,因而给转基因动物的培育和应用价值带来了新的难题。目前,学界对转基因沉默现象及其发生机制进行了广泛的研究。从所报道的转基因沉默的例子来看,几乎所有的转基因沉默现象都与外源启动子的甲基化、组蛋白乙酰化异常及外源基因拷贝数有关。在过去5年时间里,本实验室累计获得了上百只携带报告基因DsRed(Red fluorescence protein from Discosoma sp.海葵红色荧光蛋白)的PO代转基因白绒山羊,其中一部分存在转基因沉默的现象。转基因沉默现象会严重制约转基因动物外源基因的有效表达,对转基因沉默现象的机理进行研究,并对其提出可能的解决方案,可以为今后提高转基因动物外源基因的表达效率提供实验依据。本研究从以上转基因白绒山羊中选取了有代表性的6只进行研究,培养其耳尖成纤维细胞,以及一部分表皮来源的细胞。研究发现,在荧光激发器激发下,与对照组相比,在部分成年转基因白绒山羊个体及所采细胞样品中均检测不到红色荧光,这与CMV启动子的特性并不相符,表明发生了转基因沉默现象。经过对选取的转基因白绒山羊检测发现,其基因组中均具有完整的外源DsRed基因表达框。实时荧光定量PCR的结果显示,仅在编号为ZK110321的个体中DsRed mRNA较其他个体表达量稍高,但仍低于核供体细胞CFC3-KI的表达水平。Western Blot的检测结果显示,只有ZK110324-1个体和CFC3-KI细胞可以检测到DsRed蛋白的表达。并且根据来自ZK0311-1和ZK110324-1个体的成纤维细胞和表皮细胞的DsRed mRNA表达量的不同的结果可以推断,CMV启动子在白绒山羊不同组织中的沉默程度有所不同。通过实时荧光定量技术的绝对定量方法获得了6只转基因白绒山羊的外源基因拷贝数,但均与DsRed表达量无显著相关性,排除了外源基因拷贝数对DsRed基因表达量的影响。通过重亚硫酸氢盐测序的方法对转基因白绒山羊进行CMV启动子的甲基化状态的研究。本实验中6只健康转基因白绒山羊和未经克隆的核供体细胞CFC3-KI外源CMV启动子的甲基化状态数据显示,有4只成体转基因白绒山羊的外源基因启动子处于很高的甲基化状态(77.4%-88.2%)有一只处于中等偏高的甲基化状态(58.7%),有一只转基因白绒山羊外源基因启动子处于较低的甲基化状态(21.0%),未经克隆的核供体细胞甲基化程度很低(14.3%)。将以上数据与DsRed基因的表达情况关联分析后发现,转基因白绒山羊外源基因的表达水平与启动子的甲基化状态呈显著负相关。因此外源CMV启动子的甲基化水平高是外源基因沉默的主要原因。为使转基因白绒山羊细胞中发生沉默的外源基因恢复表达,本实验采用了甲基化酶抑制剂5氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Az)和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)处理的方法培养转基因白绒山羊细胞。首先以ZK0311-1和ZKl 10324-1个体的成纤维细胞和表皮细胞进行了最适药物浓度的筛选,结果为：处理成纤维细胞最适5-Az浓度为5μmol/L,TSA浓度为5μmol/L,处理表皮细胞的最适5-Az浓度为20μmol/L,TSA浓度为1μmol/L。5-Az的处理时间为7d,TSA的处理时间为24h。之后使用该浓度处理其他转基因白绒山羊耳尖成纤维细胞后获得了良好的外源DsRed基因恢复表达的效果,经5-Az的处理,使ZK110324-2耳尖成纤维细胞中DsRed mRNA的表达量提高了50.19倍；经TSA的处理,使ZK0311-1耳尖成纤维细胞中DsRed mRNA的表达量提高了15.08倍。另对5-Az处理组的6只转基因白绒山羊耳尖成纤维细胞及核供体细胞外源CMV启动子的甲基化水平进行了检测,结果表明ZK0311-1、ZK110324-1和ZK110324-2的耳尖成纤维细胞CMV启动子的甲基化水平都有显著下降,验证了5-Az降低外源基因启动子甲基化水平的有效性。在药物最适浓度筛选实验中TSA浓度与DsRed mRNA的表达量与呈剂量依赖型关系,推断组蛋白乙酰化异常也是导致转基因白绒山羊外源基因沉默的原因之一。对所获得的两只在全身和细胞水平均未表达红色荧光蛋白的转基因白绒山羊(ZK0310-1和ZK0311-1)耳尖成纤维细胞进行体细胞克隆,经过卵母细胞的综合重编程作用,红色荧光在核移植重构胚胎中获得了恢复表达。通过以上实验我们得出：转基因白绒山羊不同个体中外源基因表达并不相同,甚至发生外源基因沉默,这与外源基因的CMV启动子的甲基化以及转基因动物的组蛋白异常乙酰化有关；CMV启动子在转基因白绒山羊不同组织中的沉默程度有所不同；甲基化酶抑制剂5-Az以及去乙酰化酶抑制剂TSA的处理对转基因白绒山羊细胞的外源基因表达模式又有一定的改变作用,且使用TSA和5-Az进行处理是提高外源基因表达效率的有效措施；将外源基因沉默的转基因白绒山羊细胞作为供体细胞进行体细胞克隆也有助于外源基因的恢复表达。