固-液界面的蛋白质吸附对抗体芯片,生物传感器,免疫分析以及其它分子识别技术来说必不可少。如何在保持正确空间取向和生物活性的同时高密度固定蛋白(包括抗原和抗体)是这些技术成功的关键因素,尤其是在微型化高通量平台中更是如此,例如微流控和纳流控芯片技术,这些处于领先地位的分析技术允许在同一实验中进行几千种分析物的并行检测。然而,吸附于固相基体表面的大部分蛋白质分子常常因接触基体刚性平面而导致其上的免疫结合位点被遮蔽,从而无法接近并识别对应的分析物,在后续检测中不能产生有效免疫响应,难以达到高灵敏、高通量的要求。为解决这一问题,本文致力于蛋白质分子在固-液界面吸附行为取向的控制与分析方法研究,以期最大程度地保持蛋白质分子的生物活性,达到靶向吸附的效果。1)用噬菌体随机展示肽库筛选得到能与聚苯乙烯(polystyrene,PS)基体亲和结合的12肽(我们称之为亲和标签肽)。3轮淘选后,通过对与聚苯乙烯亲和结合的噬菌体克隆进行测序,发现含有较多的芳香族氨基酸残基,芳香族氨基酸与聚苯乙烯的苯环之间存在p-p叠加效应——这可能是亲和标签肽对聚苯乙烯具有结合能力的原因。将淘选过程中出现次数最多的聚苯乙烯亲和标签肽命名为 Ligl(序列为 FKFWLYEHVIRG)。2)通过基因融合的方法将亲和标签肽Lig1插入ENV重组抗原的N端和C端,表达能被抗-HIV-1特异性抗体识别的亲和标签肽融合抗原,在此基础上建立抗-HIV-1 的酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测体系。在该ELISA体系下考察原核表达的亲和标签肽融合抗原在PS基体表面的吸附特征。实验结果表明亲和标签肽融合抗原具有更强的亲和吸附能力,并能以活性位点统一朝外的方式靶向吸附至聚苯乙烯微孔板,其吸附过程很少受到共存蛋白的干扰。采用Lig1-ENV作为包被抗原的抗-HIV-1酶联免疫体系在血清学诊断试验中亦表现出更高的灵敏度和特异性。3)通过基因融合的方法将亲和标签肽Lig1插入HCV嵌合抗原的N端和C端,表达能被抗-HCV特异性抗体识别的亲和标签肽融合抗原。在直接和间接酶联免疫检测体系下对比考察亲和标签肽融合抗原以及不带亲和标签肽的对照抗原的免疫反应性。实验结果表明,亲和标签肽Lig1对聚苯乙烯基体有很强的亲和结合能力(HCV-Lig1与对照抗原HCV对PS基体的亲和常数分别为2.6×108 M-1和2.9×105 M-1),引导融合抗原以统一有序的方式靶向吸附至聚苯乙烯基体,抗原表面的特异性抗体结合位点得以充分暴露,由此显著提高其对分析物的检测灵敏度。原子力显微镜对吸附界面的表征结果证实亲和标签肽融合抗原能均匀、有序地吸附于聚苯乙烯基体表面,在吸附过程中与基体刚性平面接触而导致的构象扭曲也相对较轻。只要抗原的免疫结合位点不在抗原的N端和C端,亲和标签融合法应该是一种理想的蛋白质靶向吸附方案。4)通过模仿葡萄球菌干扰免疫调理的分子机制,提出了一种新颖简单的方法用于抗体的高密度靶向吸附固定。首先在葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SPA)两端非对称引入HisTag组氨酸标签,获得2分子HisTag-SPA,后者以反向平行的方式组装5分子IgG抗体。通过HisTag组氨酸标签与镍离子的螯合作用,将抗体以三维立体排布的方式吸附于固相基体表面。抗原受体位点进而得以充分暴露,对分析物HBeAg的响应信号也由此显著增强,与对照相比,检测灵敏度增大了 64倍以上。Pull-down技术证明了 IgG抗体只能经SPA的连接间接地结合至镍离子基体,位于SPA一端的组氨酸标签与镍离子结合,而5个同源结构域结合IgG抗体的Fc段。以积分光密度(IOD)定量表示的5个杂交带的信号强度随SPA所含IgG结合域的个数逐一递增(IOD值分别为:14.55、35.78、81.53、217.37、263.15),说明 Ni2+-NTA 凝胶珠经 SPA 结合的IgG抗体的量也逐渐增加。只要使用的抗体探针属于哺乳类动物IgG,该吸附固定方法即可用于构建高性能抗体阵列和生物传感器。5)将60Co γ-射线辐照改性的聚苯乙烯微孔板用于抗-HIV/抗-HCV抗体的间接酶联免疫测定。实验结果表明,经合适剂量(8-9 kGy)60Co辐照过的聚苯乙烯微孔板在血清学诊断试验中表现出比未经辐照处理的对照板高3-5倍的检测灵敏度。在酶标抗体浓度比对照低4倍以上的情况下,经60Co辐照改性的聚苯乙烯微孔板仍能保持与对照微孔板在同一灵敏度水平。吸附/解吸附实验、原子力显微镜以及X射线光电子能谱分析的结果能解释这种由辐照导致的聚苯乙烯微孔板在蛋白质吸附性能上的提升。在辐照过程中由于生成了大量的含氧基团,改善了聚苯乙烯表面的亲水性,并与蛋白质的氨基反应生成西佛碱键或肽键结构,从而能吸附更多的蛋白质分子(60Co辐照微孔板的蛋白吸附量是未辐照对照板的1.5-3倍)。直接ELISA实验结果表明60Co辐照能提高酶联免疫的灵敏度是由于聚苯乙烯微孔板对蛋白质抗原吸附量增加引起的,与包被抗原功能位点在界面的吸附取向或立体定位无关。6)通过测定抗体分子在固相基体表面的吸附量、吸附速率、吸附平衡时间以及平衡浓度,分别探讨了抗-HBeAg单克隆抗体在聚苯乙烯表面、HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附动力学和吸附热力学特征。研究表明,抗-HBeAg单克隆抗体在聚苯乙烯表面的吸附属于单分子层吸附,为放热的物理过程,Langmuir模型能更好地拟合其吸附等温线(R2≥0.995)。该吸附过程的速率受液膜扩散和颗粒扩散联合控制,采用伪一级、伪二级动力学方程对其吸附动力学曲线进行拟合均可得到较好的结果;HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附属多分子层吸附,为吸热过程,吸附量比在聚苯乙烯表面的吸附量大4-5倍,其吸附等温线符合Freundlich模型,吸附动力学行为符合伪二级动力学方程。液膜扩散模型及颗粒扩散模型均不适合用于拟合HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附,考虑到该吸附属于多分子层的多元结合模式,存在紧贴固相基体表面的边界层,因此采用Weber-Morris模型对其动力学数据进行分段拟合,拟合结果证实了这种判断。HisTag-SPA/抗-HBeAg单克隆抗体在镍离子预包被表面的吸附过程分为2个阶段,第1阶段为快速吸附阶段,该阶段蛋白质分子从液相主体扩散到固相基体表面,边界层尚未形成;第2阶段为平缓吸附阶段,是吸附速率控制步骤,涉及到边界层的形成,HisTag-SPA与抗体分子及镍离子表面的同步相互作用,以及边界层内部分子间的位点适配与结合容量的动态调整。