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本研究系统研究了产中性蛋白酶菌株的菌种选育、原生质体复合诱变及产酶条件、酶学性质和菌种保藏以及酶的保藏。 本研究论文主要包括四个方面的内容: (1)产中性蛋白酶细菌的筛选及部分酶学性质的初探 从土壤中分离纯化得到一株产中性蛋白酶菌株Bx-4,经初步鉴定为枯草芽孢杆菌。比较筛选了酪素培养基、淀粉酪素培养基、酵母膏酪素培养基、LB+酪素培养基、脱脂奶粉培养基,发现以脱脂奶粉培养基作为鉴别培养基效果较好。单因素碳、氮源及正交试验发现以2%玉米粉、3%豆粕粉作为碳、氮源并辅以3%麸皮作为生长因子产酶最好。Zn2+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+等对产酶也有不同程度的激活作用,以其中Zn2+激活作用最明显。Fe2+对产酶有强抑制作用。产酶最佳起始pH为8.0。酶学性质初步研究发现酶最适作用温度为55℃,最适作用pH为7.5,Ca2+对酶有一定的激活作用和稳定作用,Fe3+对酶有强烈的抑制作用。 (2)Bacillus subtilis Bx-4原生质体复合诱变选育产酶菌株 Bacillus subtilis Bx-4菌体生长滞后期为0-2h,7h后达到了菌种的对数生长末期,对数生长中期为5hr左右。Bacillus subtilis Bx-4对甘氨酸与青霉素非常敏感。甘氨酸最适作用浓度为2mg/mL,青霉素作用单位为1U/mL,溶菌酶作用最适浓度为2mg/mL,时间为60min。在优化条件下进行原生质体形成与再生综合实验,形成率和再生率均分别平均达到77.44%和53.07%。Bacillus subtilis Bx-4原生质体对紫外线作用不太敏感。紫外诱变筛选得到正突变株UV11。UV11经UV+HNO2诱变选育得到正突变株UN9。UN9再经UV+NTG复合诱变得到一株高产、稳定的中性蛋白酶菌株并命名为Bacillus subtilis Promax NTG14,酶活达4286.09U/mL。遗传稳定性研究表明,Bacillus subtilis Promax NTG14具有良好的遗传稳定性,传代5次酶活均保持在4000U/mL以上。 (3)Bacillus subtilis Promax NTG14产酶条件及酶学性质研究 Bacillus subtilis NTG14以玉米粉+甘油为复合碳源,以豆粕粉做为氮源,麸皮提供生长因子时产酶最好。选用L16(45)正交试验表进行正交试验,研究结果表明以2%玉米粉、2%甘油、3%豆粕粉、3%麸皮作为碳、氮源配比时对产酶最为有利。极差分析发现豆粕粉对产酶影响最为显著,甘油和玉米粉次之,麸