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三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]主产于云南文山州,为五加科人参属植物。三七是我国传统的名贵中草药,具有散瘀止血,消肿定痛的功效。由于根腐病、黑斑病等真菌病害的发生,严重影响了三七的产量和品质。其中,根腐病是三七生长过程中最为严重的病害,茄病镰刀菌（Fusarium solain）和尖孢镰刀菌（F.oxysporum）是三七根腐病的重要致病菌。前期研究发现,外源茉莉酸甲酯（MeJA）预处理三七根部可明显提高三七对茄腐镰刀菌的抗性。因此,采用高通量测序技术对MeJA预处理三七在茄腐镰刀菌侵染过程进行转录组测序和基因表达谱分析。转录组数据分析发现两个三七抗菌肽基因受外源MeJA处理诱导,并且响应茄腐镰刀菌侵染。为了深入认识这两个抗菌肽在三七与茄腐镰刀菌互作过程中的功能,本文进行了以下研究及得到的结果如下:1.利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术从三七中克隆得到一个defensin类似蛋白基因（PnDEFL1）的全长cDNA序列。PnDEFL1 cDNA序列全长为702 bp,编码一个含77个氨基酸残基的蛋白质。在茄腐镰刀菌侵染过程中,与无菌水预处理三七相比,外源MeJA预处理三七能显著提高PnDEFL1的转录水平。四种信号分子MeJA、ETH、H2O2和SA处理均不同程度地诱导三七根中PnDEFL1的表达水平。构建亚细胞定位载体pBIN m-gfp5-ER-PnDEFL1,转化根癌农杆菌EHA105,浸染洋葱表皮细胞,共培养两天后通过激光共聚焦显微镜检测PnDEFL1-GFP融合蛋白的定位。结果显示绿色荧光特异性分布在细胞壁中,表明PnDEFL1蛋白定位于植物细胞壁中。去信号肽构建原核表达载体pET-32a-PnDEFL1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导PnDEFL1重组蛋白的表达,PnDEFL1原核重组蛋白分子量约为25 kDa。通过镍亲和层析纯化得到PnDEFL1重组蛋白,体外平板抑菌实验结果显示重组蛋白对四种病原真菌茄腐镰刀菌、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、尖孢镰刀菌和核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的菌丝生长有明显的抑制作用,并且蛋白浓度与其体外抑真菌活性正相关。同时,PnDEFL1原核重组蛋白对茄腐镰刀菌孢子的萌发有抑制作用,与对照（PDA液体培养基）相比,加入PnDEFL1原核重组蛋白的孢子萌发率为约33%。构建了PnDEFL1的植物超表达载体pCAMBIA2300S-PnDEFL1,转入烟草中过表达,并培育获得T2代转基因烟草。qPCR分析结果表明,PnDEFL1在T2代转基因烟草中稳定地表达。用茄腐镰刀菌接种烟草叶片及根部,与野生型烟草相比,PnDEFL1转基因烟草株系对茄腐镰刀菌的抗性大大增强。此外,构建了PnDEFL1的RNAi载体pHellsgate 2-PnDEFL1,通过根癌农杆菌介导转入三七幼嫩叶片中瞬时表达,农杆菌浸染24 h后接种茄腐镰刀菌,接种72 h后表达PnDEFL1 RNAi构建体的三七叶片产生的病斑面积显著大于对照三七（转化RNAi空载体）。上述实验结果表明PnDEFL1是三七中重要的抗病基因。2.利用RACE技术从三七中克隆得到一个三七snakin抗菌肽基因（PnSN1）的全长cDNA序列。PnSN1 cDNA序列全长为677 bp,编码一个含104个氨基酸残基的蛋白质。四种信号分子MeJA、ETH、H2O2和SA处理均不同程度地诱导三七根中PnSN1的表达水平。与无菌水预处理三七相比,外源MeJA预处理三七根部能显著提高在茄腐镰刀菌侵染过程中PnSN1的转录水平。亚细胞定位结果PnSN1与GFP融合蛋白产生的绿色荧光特异性分布在细胞壁中,表明PnSN1蛋白定位于植物细胞壁。去信号肽构建原核表达载体pET-32a-PnSN1,转入大肠杆菌BL21（DE3）,诱导PnSN1重组蛋白的表达,PnSN1原核重组蛋白分子量约为28 kDa。体外平板抑菌实验结果显示PnSN1原核重组蛋白对四种病原真菌茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌（F.verticillioide）、葡萄座腔菌的菌丝生长有明显的抑制作用,并且随着蛋白浓度的提高,抑制活性也随之增强。同时,PnSN1原核重组蛋白对茄腐镰刀菌孢子萌发有抑制作用,加入PnSN1原核重组蛋白的孢子萌发率约为32%。构建了PnSN1的植物超表达载体pCAMBIA2300S-PnSN1,根癌农杆菌介导转入烟草中。用茄腐镰刀菌接种T2代转基因烟草的叶片,与野生型烟草相比,PnSN1转基因烟草株系对茄腐镰刀菌的抗性明显增强,表明PnSN1的过表达赋予了转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性。同时还构建了PnSN1的RNAi载体pHellsgate 2-PnSN1,通过根癌农杆菌介导转入三七幼嫩叶片中瞬时表达,农杆菌预处理后接种茄腐镰刀菌,接种72 h后,表达PnSN1 RNAi构建体的三七叶片产生的病斑面积显著大于对照三七（转化RNAi空载体）。上述研究结果表明PnSN1是三七中响应茄腐镰刀菌侵染的重要抗病功能基因。对三七snakin、defensin抗菌肽基因的克隆及PnSN1和PnDEFL1的功能分析揭示了snakin、defensin抗菌肽基因参与三七与茄腐镰刀菌的分子互作,为深入探讨三七的抗病防卫分子机制奠定了基础,同时也为植物抗病基因工程提供了候选基因。