论文部分内容阅读
第一部分:(cRGD)2/HSA@ABZ纳米药物的制备及靶向三阴性乳腺癌作用的实验研究目的:制备合成(cRGD)2修饰的人血清白蛋白包裹的阿苯达唑纳米药物[(cRGD)2/HSA@ABZ NPs],并研究其在三阴性乳腺癌中的靶向作用。方法:自组装法合成HSA@ABZ NPs,共价修饰环cRGD二聚体,构建(cRGD)2/HSA@ABZ NPs。透射电镜观察纳米粒子形态,动态光散射检测纳米粒径、表面电势,测定纳米粒子体外稳定性、释放率,超滤离心法及HPLC检测药物的包封率和装载率。氯氨T法标记131I,测定放射性标记率,薄层纸层析法测定放射化学纯度和血清放射稳定性。体外溶血试验评估纳米药物的生物毒性。选取三阴性乳腺癌4T1和MDA-MB-231细胞系。取对数生长的4T1细胞和MDA-MB-231细胞分别接种于5-6周龄雌性BALB/c小鼠和BALB/c裸鼠右侧腋区皮下,建立4T1荷瘤鼠模型和MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型。当肿瘤体积长至约200mm~3,尾静脉注射131I标记的纳米药物,于不同时间点行小动物活体成像。成像结束后,安乐死小鼠,取肿瘤组织及主要器官,测药物组织分布情况。结果:成功制备了HSA@ABZ NPs和(cRGD)2/HSA@ABZ NPs。电镜显示HSA@ABZ NPs和(cRGD)2/HSA@ABZ NPs呈球形,大小均一,平均尺寸分别为(108.03±10.88)nm和(113.79±1.65)nm,水合粒径分别为(192.20±2.07)nm和(196.70±2.42)nm,分散性好,药物包封率分别为(58.97±2.28)%和(56.46±1.90)%,药物装载率分别为(6.03±0.233%和(5.64±0.25)%。PH和氧化还原双重响应条件下,(cRGD)2/HSA@ABZ NPs体外72小时ABZ释放率可达80%以上。131I标记率分别为(80.96±3.51)%和(79.71±1.72)%,放化纯分别为(93.76±1.43)%和(94.98±0.59)%,24小时人血清放射稳定性分别为(91.40±0.50)%和(91.00±1.60)%。1h红细胞溶血率分别为(1.50±1.30)%和(1.00±0.60)%。小动物活体成像显示,在4T1荷瘤鼠模型中,注射后24小时即可见131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs在肿瘤部位的放射性浓聚,持续至48小时,注射后48小时方可见131I-HSA@ABZ NPs在肿瘤部位的放射性浓聚,且持续时间较短;在MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型中,131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs在肿瘤部位的放射性浓聚亦出现在注射后24小时,131I-HSA@ABZ NPs的浓聚则出现在注射后36小时。4T1荷瘤鼠模型肿瘤部位48h药物分布分别可达2.60%ID/g和4.14%ID/g(131I-HSA@ABZ NPs vs 131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs,p<0.05);MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型肿瘤部位72h组织分布两者亦存在统计学差异(131I-HSA@ABZ NPs vs131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs,p<0.05)。结论:(cRGD)2/HSA@ABZ NPs具有良好的生物学特性;能够有效靶向三阴性乳腺癌,具有良好的药物组织分布,为进一步研究(cRGD)2/HSA@ABZ NPs靶向治疗三阴性乳腺癌奠定了基础。第二部分:131I-(cRGD)2/HSA@ABZ放射性纳米药物靶向治疗三阴性乳腺癌疗效及机制的实验研究目的:探讨131I标记的(cRGD)2/HSA@ABZ放射性纳米药物对三阴性乳腺癌的体内外治疗效果,并初步研究相关抑瘤机制。方法:荧光共聚焦显微镜观察三阴性乳腺癌细胞对纳米药物摄取情况。MTT法、结晶紫法及集落形成实验测定纳米药物对细胞增殖影响。Annexin V/PI凋亡试剂盒检测纳米药物对细胞凋亡影响。分别构建4T1荷瘤鼠及MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型,待肿瘤体积约100mm~3时,随机分组,5只/组,给予不同处理,每两天尾静脉注射给药,隔天测肿瘤体积及小鼠体重,待肿瘤体积长至约1000mm~3终止实验,处死小鼠,取肿瘤组织称重。MDA-MB-231荷瘤裸鼠治疗结束后,腹主动脉抽血行生化分析,肿瘤组织切片,TUNEL检测纳米药物对乳腺癌凋亡的影响,免疫组化分析肿瘤增殖、血管生成等情况;取主要器官,行H&E染色,观察各脏器病理变化及肿瘤转移情况。在抗肿瘤机制方面,蛋白印迹分析法(western bolt)检测相关通路蛋白(p-AKT、p-m TOR、p-P70S6K、p-4E-BP1、p-ERK、p-P38、p-JNK、LC3I/II及内参GAPDH)在乳腺癌细胞中的表达水平。结果:MDA-MB-231细胞呈时间依赖性地摄取(cRGD)2/HSA@ABZ NPs。MTT及结晶紫克隆实验结果显示,各种药物均呈浓度依赖性抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、抑制细胞克隆形成,其中目标纳米药物131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs对4T1和MDA-MB-231细胞的最高抑制率分别可达(74.42±2.15)%和(59.25±2.35)%;而其对非三阴性乳腺癌MCF-7细胞的最高抑制率仅为(39.20±1.64)%。(cRGD)2/HSA@ABZ NPs显著抑制MDA-MB-231细胞集落形成,促进细胞凋亡。4T1荷瘤鼠体内治疗实验显示,治疗终止时131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs治疗组和阴性对照组肿瘤体积分别为(493.38±127.41)mm~3和(1053.80±80.60)mm~3,两组存在显著统计学差异(p<0.05)。MDA-MB-231荷瘤裸鼠体内治疗结果显示,治疗终止时131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs治疗组与阴性对照组肿瘤体积分别为(201.053±57.460)mm~3和(753.114±207.456)mm~3,两组存在显著统计学差异(p<0.05)。治疗终止时各组血生化指标AST、ALT、ALP、GGT、CRE及URE均无显著差异(P>0.05)。TUNEL结果显示,131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs治疗组肿瘤细胞凋亡率显著上升,与阴性对照组之间存在显著统计学差异(p<0.05)。免疫组化分析表明,131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs治疗显著抑制肿瘤细胞增殖,增强肿瘤细胞自噬,而肿瘤血管生成无明显改变。Western blot结果显示药物处理组MDA-MB-231细胞p-AKT、p-m TOR、p-ERK、p-P38及p-JNK蛋白表达水平下降,p-4E-BP1、LC3I/II蛋白表达水平升高,而p-P70S6K水平则无明显变化。结论:本实验研究发现131I-(cRGD)2/HSA@ABZ NPs在体内外显著抑制三阴性乳腺癌的生长,其抑瘤机制可能与上调AKT/m TOR/4E-BP1信号通路及下调MAPKs磷酸化水平抑制肿瘤增殖、促进肿瘤凋亡及自噬有关。