自由流电泳是一种无支持介质的全液相电泳技术。与其他电泳技术相比,最大优势是分离环境温和、可持续性分离和兼容几乎所有的电泳模式。自由流电泳温和的液相环境利于生物活性的保存,广泛应用于蛋白质、多肽、细胞、细胞器、病毒等生物活性分子和颗粒的分离制备。持续分离的能力赋予了自由流电泳在生物制备领域的应用潜力,适用于小规模的制备分离。自由流电泳可兼容几乎所有的电泳模式,包括区带电泳、等电聚焦电泳、等速电泳、场梯度电泳及移动反应界面电泳等。多电泳模式的兼容性拓展了自由流电泳的应用范围。本文着重研究自由流等电聚焦电泳技术及其应用,同时对自由流区带电泳和自由流移动反应界面电泳做了部分研究。自由流等电聚焦电泳在几种电泳模式中拥有最高的分辨率,在蛋白质组研究中常用作预分离手段。针对现有自由流等电聚焦电泳技术存在的问题,本文设计了新型的自平衡-循环式自由流等电聚焦装置和新型往复式自由流等电聚焦装置,并应用于生物样品的制备分离。研究的具体内容包括:(1)自平衡-循环式自由流等电聚焦装置的设计及应用。在本实验室之前发展的重力自平衡-连续式自由流电泳装置基础上,设计了新型自平衡-循环式自由流等电聚焦装置。使用多道恒流泵驱动缓冲溶液在重力平衡储液管,分离室,多道恒流泵之间形成循环,实现多次等电聚焦。设计初期分离室为水平设置,后期改为与水平成75°的立式设置,使装置结构更加简化。使用该装置纯化了家兔肝脏中提取的线粒体,得到了不同形态的线粒体,为后续蛋白质组研究打下了基础。该装置的优点在于将重力自平衡技术引入传统循环式自由流等电聚焦装置中,使分离室中载体缓冲溶液的流型更加稳定,整个装置的结构更加简单;(2)设计了新型往复式自由流等电聚焦装置。使用往复式循环替代了传统的单向环型循环,缓冲溶液在临时储液管、分离室和气液缓冲腔之间往复流动,反复多次流经分离室,实现多次等电聚焦。该装置优点是使用单道驱动泵替代了昂贵复杂的多道驱动泵,克服了循环式等电聚焦装置复杂、昂贵等固有缺陷。实验中优化了该装置的操作程序,并使用该装置对模式蛋白质和人血清蛋白分别进行了分离,实验结果表明该装置具有很好的稳定性和较高的分辨率。在本文第二部分中,对自由流移动反应界面电泳在蛋白质浓缩中的应用进行了研究。首先对移动反应界面在自由流电泳中的形成过程和界面移动速度进行了阐释,然后对蛋白质在自由流移动反应界面中的浓缩条件,最大通量及上样策略等进行了探讨。通过一系列实验对上述理论进行了验证,实验结果表明自由流移动反应界面电泳中蛋白质可被有效浓缩在单一出液口中,得到了12.6倍的最高浓缩倍数,回收率和处理速度分别达到95.5%和125.7 ml/h。本文第三部分中探讨了自由流区带电泳的载体缓冲溶液优化策略。本实验室之前工作中曾提出一种通过分析蛋白质荷质比分布来优化载体缓冲溶液的策略,有效减少了实验中的工作量。但该策略只研究了载体缓冲溶液对蛋白质荷质比差异的影响,未考虑载体缓冲溶液对蛋白质条带拓宽造成的影响。基于上述原因,本文提出了新的载体缓冲溶液优化策略:1)计算蛋白质的荷质比随pH值变化,分析蛋白质在不同pH环境下荷质比差异;2)分析不同pH环境对条带拓宽情况的影响;3)结合荷质比差异及条带拓宽分析,找出最佳分离条件。在模式蛋白质分离实验中证明了该策略的有效性,此外,在该策略的帮助下从钝顶螺旋藻的粗提液中纯化了藻蓝蛋白,得到了分析级产品。