论文部分内容阅读
研究背景和研究目的心肌慢性缺氧是临床多种心脏疾病重要的病理生理改变。已有研究证实,线粒体生物合成增加是心肌细胞在慢性缺氧条件下的适应机制之一,严格控制心肌细胞线粒体的数量和质量对于促进心肌细胞存活和维持心肌功能尤为重要。线粒体自噬是一种特殊的自噬形式,能选择性地清除功能失调以及细胞不需要的线粒体,是线粒体质量控制的重要环节。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一种Ser/Thr蛋白激酶,广泛存在于真核细胞中,是维持细胞代谢平衡和内环境稳定的重要调控分子,在慢性缺氧条件下,AMPK活化增加,而且,最近的研究表明AMPK能通过多种途径激活细胞自噬的发生,因此我们推测AMPK也参与对慢性缺氧心肌细胞线粒体自噬的调控,实现对慢性缺氧心肌的保护。本研究将以临床先天性心脏病患者心肌组织和H9c2心肌细胞为研究对象,观察慢性缺氧条件下心肌细胞线粒体的生物合成、线粒体的功能改变、线粒体自噬的发生以及AMPK激活对心肌细胞线粒体自噬的影响,旨在探讨在慢性缺氧条件下,参与调控心肌细胞线粒体自噬和线粒体质量控制的潜在分子机制,为临床治疗缺氧性心脏病提供新的治疗靶点。研究方法选取第三军医大学新桥医院心血管外科需手术矫治的先天性心脏病20例,根据术前血氧饱和度分为非紫绀型先心病组(10例)和紫绀型先心病组(10例),取术中切除的右室流出道心肌组织作为标本,采用qRT-PCR检测心肌组织线粒体DNA相对拷贝数,采用Western blot法检测心肌组织中AMPK活化水平。选用H9c2心肌细胞株,并将其分为常氧组、缺氧组、激活组、阻断组。激活组和阻断组分别加入激活剂AICAR和AMPK阻断剂Compound C,将缺氧组、激活组、阻断组细胞置于缺氧培养箱(94%N2,5%CO2,1%O2)培养48h,建立H9c2心肌细胞慢性缺氧模型;常氧组放置于细胞培养箱(74%N2,5%CO2,21%O2)。分别采用qRT-PCR检测常氧组和缺氧组心肌细胞线粒体DNA相对拷贝数,Western blot检测各组心肌细胞p-AMPK、AMPK蛋白表达情况,线粒体探针和免疫荧光染色观察线粒体自噬情况,线粒体探针(mitotracker)和罗丹明123共同染色检测线粒体膜电位变化,流式细胞技术检测线粒体膜电位变化以及细胞凋亡情况。结果1、与非紫绀组病人相比,紫绀组病人心肌组织线粒体dna相对拷贝数明显增加[mtdna/ndna比值:非紫绀组(1.17±0.26);紫绀组(1.97±0.39),p<0.05],p-ampk、ampk蛋白表达量的比值升高[非紫绀组(1);紫绀组(1.83±0.21),p<0.05]。2、与常氧组心肌细胞相比,缺氧组心肌细胞线粒体dna相对拷贝数明显增加[mtdna/ndna比值:常氧组(1);缺氧组(3.43±0.65),p<0.05],p-ampk、ampk蛋白表达量的比值升高[常氧组(1);缺氧组(1.72±0.16),p<0.05],膜电位正常的线粒体减少[膜电位正常线粒体的比例:常氧组(89.00±2.94)%;缺氧组(67.75±8.66)%,p<0.05],线粒体膜电位降低细胞的比例升高[常氧组(25.90±2.72)%,缺氧组(32.73±2.15)%,p<0.05],线粒体自噬体增多[未使用氯喹,常氧组(1.4±1.14),缺氧组(10.6±3.05),p<0.05;使用氯喹,常氧组(4.2±1.92),缺氧组(21.6±6.73),p<0.05],凋亡细胞比例增加[常氧组(1.69±0.66)%,缺氧组(5.01±2.18)%,p<0.05]。3、与缺氧组相比,ampk激活组线粒体自噬体增多[未使用氯喹,缺氧组(10.6±3.05),激活组(28.3±3.96),p<0.01;使用氯喹,缺氧组(21.6±6.73),激活组(42.4±5.73),p<0.01],膜电位正常的线粒体比例升高[缺氧组(67.75±8.66)%,激活组(87.25±2.75)%,p<0.05],线粒体膜电位降低细胞的比例下降[缺氧组(32.73±2.15)%,激活组(24.60±2.01)%,p<0.01],凋亡细胞比例减少[缺氧组(5.01±2.18)%,激活组(2.10±0.94)%,p<0.05],ampk阻断组线粒体自噬体形成减少[未使用氯喹,缺氧组(10.6±3.05),阻断组(2.6±2.07),p<0.01;使用氯喹,缺氧组(21.6±6.73),阻断组(4.80±2.39),p<0.01],膜电位正常的线粒体比例降低[缺氧组(67.75±8.66)%,阻断组(44.19±3.66)%,p<0.05],线粒体膜电位下降细胞的比例升高[缺氧组(32.73±2.15)%,阻断组(41.10±1.16)%,p<0.01],凋亡细胞比例增加[缺氧组(5.01±2.18)%,阻断组(7.06±2.23)%,p<0.05]。结论1、在慢性缺氧条件下,心肌细胞线粒体生物合成增加,同时也造成线粒体损伤增加,线粒体自噬增强。2、慢性缺氧引起心肌细胞AMPK激活;而AMPK激活通过参与慢性缺氧心肌细胞线粒体自噬调控,在实现线粒体质量控制和对慢性缺氧心肌保护中发挥重要作用。