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食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,它是一种高侵袭性的肿瘤。Smad7是TGF-β信号通路元件之一,对TGF-β信号转导发挥负性调控,抑制TGF-β信号转导。TGF-β信号转导过程如下:活化的TGF-β首先直接与Ⅱ型受体结合(TβRⅡ)形成复合物,TGF-β构型发生变化,从而可被Ⅰ型受体(TβRⅠ)识别并结合,形成TβRⅡ-TGF-β-TβRⅠ三聚体复合物,复合物中的TβRⅠ被TβRⅡ磷酸化,磷酸化的TβRⅠ在胞浆内与R-Smads(Smad2,Smad3)结合并将R-Smads磷酸化,后者与Smad4形成异源寡聚复合物,进入细胞核与特异的DNA结合,随后发生转录反应,抑制上皮细胞增殖。Smad7位于染色体18q21.1上,介于MADR2与DPC4之间,两者分别编码Smad2和Smad4蛋白。该位点等位基因的丢失见于多种恶性疾病,并且与其预后差密切相关。Smad7表达的紊乱,可影响细胞对TGF-β的应答,从而促进细胞的恶性进展。国内外研究表明在多种类型肿瘤如乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等中都存在Smad7表达异常。目前对于在食管鳞癌是否存在Smad7表达异常,其在食管鳞癌中发生发展、浸润转移中的作用是什么,国内外研究尚少。本研究采用免疫组化技术检测食管鳞癌组织中Smad7、TβRⅡ、Smad3的表达及相关性;采用RT-PCR、western-blot检测食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7siRNA前后Smad7、TβRⅡ、Smad3的表达;采用倒置显微镜、MTT法、Boydenchamber体外侵袭实验检测食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后细胞形态、增殖能力及体外侵袭能力的改变。材料和方法1.采用免疫组织化学技术检测100例手术切除的食管鳞癌组织及其癌旁正常粘膜中Smad7、TβRⅡ和Smad3蛋白的表达情况。2.采用RNA干扰技术使食管鳞癌细胞株EC-1中Smad7基因沉默,倒置显微镜观察Smad7基因沉默后食管鳞癌细胞株EC-1形态学的变化。3.采用RT-PCR、Western-blot法检测食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7siRNA后24h、48h、72h Smad7、TβRⅡ、Smad3 mRNA及蛋白的表达。4.采用MTT法检测食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后24h、48h、72h细胞增殖能力改变。5.采用Boyden chamber体外侵袭实验检测食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7siRNA后24h、48h、72h细胞体外侵袭力改变。6.统计学处理:所有数据均经SPSS13.0软件进行统计分析。计数数据采用阳性率表示,阳性率之间的比较采用x~2检验(Chi-square),阳性率间相关性采用Kendall等级相关进行比较;计量数据采用(?)±S表示,两组均数的比较用t检验(t-test),两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA)。显著性水平a=0.05。结果1.食管鳞癌组织中Smad7蛋白阳性表达率(80.0%)明显高于正常食管黏膜(58.0%)(P＜0.01)。Smad7蛋白表达与浸润深度有关,其在深层浸润组阳性表达率明显(89.1%)高于浅层浸润组(63.9%)(P＜0.01);Smad7蛋白表达与淋巴结转移有关,其在有淋巴结转移组阳性表达率(100%)明显高于无淋巴结转移组(74.4%)(P＜0.05);Smad7蛋白表达与病理分级无关(P＞0.05)。2.食管鳞癌组织中TβRⅡ蛋白阳性表达率(42.0%)明显低于正常食管黏膜(82.0%)(P＜0.01)。TβRⅡ蛋白表达与浸润深度有关,其在深层浸润组阳性表达率明显(37.5%)低于浅层浸润组(50.0%)(P＜0.05);Smad7蛋白表达与病理分级有关,Ⅲ级阳性表达率(18.2%)明显低于Ⅰ级阳性表达率(60.0%)(P＜0.05);TβRⅡ蛋白表达与淋巴结转移有关,其在有淋巴结转移组阳性表达率(18.2%)明显低于无淋巴结转移组(48.7%)(P＜0.05)。3.食管鳞癌组织中Smad3蛋白阳性表达率(68.0%)明显低于正常食管黏膜87.0%)(P＜0.01)。Smad3蛋白表达与淋巴结转移有关,其在有淋巴结转移组阳性表达率(27.3%)明显低于无淋巴结转移组(79.5%)(P＜0.01);Smad3蛋白表达与浸润深度和病理分级均无关(P＞0.05)。4.食管鳞癌组织中Smad7表达与TβRⅡ和Smad3均呈负相关(P＜0.05);TβRⅡ表达与Smad3呈正相关(P＜0.01)。5.食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后,Smad7siRNA转染组细胞形态变圆,颗粒增多,呈立方形或椭圆形;而对照组细胞贴壁生长良好,细胞轮廓清楚,呈纺锤形或长梭形。6.食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后RT-PCR结果显示,各时间段(24h、48h、72h)Smad7siRNA转染组Smad7mRNA的表达均显著低于对照组(P＜0.05),并随时间延长逐渐降低(P＜0.05);Smad7siRNA转染后72h,Smad7siRNA组TβRⅡmRNA的表达与细胞对照组,单纯脂质体组相比明显升高(P＜0.01);转染后48h、72h,Smad7siRNA组Smad3 mRNA的表达与细胞对照组,单纯脂质体组相比明显升高(P＜0.05)。Smad7siRNA组,转染后48 h、72 h与24 h比,Smad3 mRNA的表达明显升高(P＜0.05)。Smad7siRNA组,转染后72 h与48 h比,Smad3 mRNA的表达明显升高(P＜0.05)。7.食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后Western-blot结果显示,各时间段(24h、48h、72h)Smad7siRNA转染组Smad7蛋白的表达均显著低于对照组(P＜0.05),并随时间延长逐渐降低(P＜0.05)。Smad7siRNA转染后72h,Smad7siRNA组TβRⅡ蛋白的表达水平与细胞对照组,单纯脂质体组相比升高明显(P＜0.01):Smad7siRNA转染48h、72h,Smad7siRNA组Smad3蛋白的表达水平与细胞对照组,单纯脂质体组相比明显升高(P＜0.05)。Smad7siRNA转染后,Smad7siRNA组Smad3蛋白表达随时间延长逐渐升高,48h、72h与24h比显著升高(P＜0.05)。8.食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后MTT结果显示,转染48h、72h后Smad7siRNA组A值与单纯脂质体组,细胞对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。9.食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后Boyden chamber体外侵袭实验结果显示,24h、48h、72h,Smad7siRNA转染组与对照组相比,穿越Matrigel胶的细胞数均明显减少(P＜0.05)。结论1.食管鳞癌组织中Smad7蛋白表达增高,TβRⅡ蛋白、Smad3蛋白表达降低,且Smad7、TβRⅡ及Smad3蛋白在食管鳞癌组织中异常表达与病理学特征密切相关,提示这三种蛋白表达异常与食管鳞癌的发生发展、浸润转移关系密切。2.食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后,下调细胞Smad7mRNA及蛋白的表达,成功沉默Smad7表达,且其抑制作用具有特异性和时间依赖性。为食管鳞癌中针对Smad7的肿瘤基因治疗提供了新的策略和技术平台。3.食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后,细胞增殖受到抑制,细胞体外侵袭能力降低。提示Smad7 siRNA能够有效抑制食管癌的恶性进展,Smad7可望作为辅助治疗靶点在食管癌治疗中发挥作用。4.食管鳞癌组织中Smad7表达与TβRⅡ和Smad3均呈负相关;TβRⅡ的表达与Smad3的表达呈正相关。食管鳞癌细胞株EC-1转染Smad7 siRNA后,Smad7siRNA能够上调TβRⅡ、Smad3的表达。提示食管鳞癌中Smad7可能导致肿瘤细胞对TGF-β诱导的抑制信号失去敏感性,使TGF-β成为肿瘤促进因子。