论文部分内容阅读
研究目的目前,胃癌(Gastric cancer GC)是临床上常见的恶性肿瘤之一,其致死率位于肿瘤的前列,这与肿瘤转移及临床抗血管治疗的疗效差有关。肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry VM)是一种特殊的肿瘤血液供应模式,它和内皮依赖性血管不同,其管壁是由肿瘤细胞构成。VM影响肿瘤的进展及不良预后,其形成和EMT及肿瘤干细胞有关。HMGA2(High mobility group protein A2)在癌症的进展过程中发挥重要作用,它不仅可以诱导EMT的发生还可以影响肿瘤干细胞的特性。然而,到目前为止,在胃癌中,HMGA2和VM的关系仍然不清楚,因此本研究拟探讨HMGA2在胃癌VM形成的作用及分子机制。利用免疫组织化学染色技术初步分析了228例胃癌组织中HMGA2和VM的关系,并通过细胞实验及裸鼠移植瘤模型验证了HMGA2可以促进肿瘤的VM形成、EMT发生,增强肿瘤细胞的干性,同时利用Ch IP/Co-IP等技术阐明了HMGA2影响VM形成的具体分子机制,为临床胃癌的抗血管治疗提供了新的思路和靶点。研究方法1.收集天津医科大学总医院和附属肿瘤医院经手术切除的胃癌组织标本228例,经病理医师再次确诊后随访,应用免疫组化和CD34/PAS双重染色方法检测胃癌组织中HMGA2的表达水平和VM存在情况。分析HMGA2的表达与胃癌临床病理因素、VM之间的相关性及其与患者生存预后的关系。2.应用免疫组化检测人体胃癌组织中EMT相关指标(E-cadherin、Vimentin、Twist1、β-catenin)、VM相关指标(VE-cadherin、VEGF、MMP2)及干性指标(CD44)表达,并进一步分析这些指标和HMGA2的相关性。3.应用Western blot筛选出本底低表达和高表达HMGA2的胃癌细胞系,构建HMGA2过表达质粒和sh RNA质粒,通过质粒转染方法分别上下调HMGA2,并筛选出相应的稳定转染的细胞系。随后用Western blot鉴定转染效果,RT-PCR及Western blot分别检测EMT相关指标(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Twist1)、VM相关指标(VE-cadherin、VEGF、MMP2、MMP9)及干性相关指标(CD44、ALDH1、Sox2、OCT4、c-Myc)的表达变化,免疫荧光检测EMT、VM及干性相关指标(E-cadherin、Vimentin、Twist1、VE-cadherin、CD44、ALDH1)的表达。4.运用划痕、侵袭、迁移实验,MTT增殖、平板克隆形成、无血清悬浮成球实验及Matrigel三维培养实验检测HMGA2对胃癌细胞的侵袭、迁移,增殖,管道形成能力的影响。5.通过双荧光素酶报告基因实验检测HMGA2与Twist1的关系,并通过Co-IP、Ch IP验证HMGA2和Twist1的互作关系。在HMGA2低表达的胃癌细胞系中,通过上调HMGA2及上调HMGA2并同时下调Twist1,应用Western blot及细胞功能实验(迁移实验及体外三维培养)进而验证HMGA2与Twist1的相互作用。6.通过将稳定过、降表达HMGA2的胃癌细胞系接种到裸鼠皮下,构建裸鼠胃癌移植瘤模型,再次验证HMGA2对胃癌的作用。通过测量并绘制肿瘤生长曲线,检测HMGA2对肿瘤体积及重量的影响;应用IHC、Endomucin/PAS双染技术检测EMT、VM及CSC相关蛋白的表达情况及VM的形成情况,进一步验证HMGA2对胃癌疾病进展的影响。研究结果1.228例胃癌临床病例样本中,发现65例有VM结构,HMGA2呈阳性表达的有88例(38.6%);具有VM的患者中有42例标本HMGA2阳性(64.6%),且HMGA2与VM-PAS计数具有相关性(r=0.4194,P<0.001);HMGA2、VM均与肿瘤的组织分型、TNM分期、肿瘤的远处转移及复发相关;Kaplan-Meier分析显示,胃癌患者中HMGA2、VM与肿瘤的不良预后相关。2.在胃癌组织中,Pearson检验结果显示HMGA2与Twist1、VE-cadherin、VEGF、E-cadherin、Vimentin、β-catenin、MMP2、CD44的表达存在相关性;进一步分析发现HMGA2的表达与VE-cadherin、Twist1的表达呈正相关(r=0.3254,P<0.001;r=0.208,P=0.016)。3.在胃癌细胞系(MKN45、MGC803、MKN28、MKN74)中,筛选出低表达HMGA2的细胞系MKN74、MKN28,高表达HMGA2的细胞系MKN45、MGC803。在胃癌细胞系MKN74和MKN28中转染HMGA2的过表达质粒后,无论是m RNA还是蛋白水平,Twist1和VE-cadherin均表现为表达增高,在蛋白水平E-cadherin表达降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Snail、VEGF及干性相关指标(CD44、ALDH1、Sox2、OCT4、c-Myc)表达增高。转染了HMGA2下调质粒的胃癌系胞系MKN45和MGC803在m RNA和蛋白水平,均表现为Twist1和VE-cadherin表达降低,在蛋白水平E-cadherin表达增高,N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Snail、VEGF及干性相关指标(CD44、ALDH1、Sox2、OCT4、c-Myc)表达降低。4.胃癌细胞系MKN74和MKN28过表达HMGA2后,细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成均增强(P<0.05)。胃癌细胞系MKN45和MGC803下调HMGA2后,细胞的侵袭、迁移、增殖及管道形成均降低(P<0.05)。5.双荧光素酶报告基因检测结果表明HMGA2可以增加Twist1、c-Myc的启动子的活性。Co-IP、Ch-IP实验结果进一步验证了HMGA2和Twist1存在互作关系。为了进一步证明HMGA2是通过调控Twist1影响VM的形成,我们在上调HMGA2的细胞系同时转染Twist1的下调质粒,结果表明细胞的迁移能力、管道形成能力明显降低,同时N-cadherin、Vimentin、VE-cadherin的表达降低,但E-cadherin的表达水平没有变化。6.同对照组比较,MKN74-HMGA2组移植瘤生长快、肿瘤体积大、重量增加,且肿瘤组织中EMT、VM相关蛋白(Vimentin、β-catenin、Twist1、VE-cadherin、VEGF、MMP2、)表达均升高,E-cadherin表达降低,CD44表达升高。同对照组相比较,MGC803-sh-HMGA2移植瘤生长慢、体积小、重量减少,且肿瘤组织中EMT及VM相关蛋白(Vimentin、β-catenin、Twist1、VE-cadherin、VEGF、MMP2)表达均降低,E-cadherin表达增高,CD44表达降低。研究结论1.胃癌组织中存在VM,且VM和胃癌的恶性生物学行为相关;HMGA2与VM关系密切,并影响病人生存预后;且HMGA2和VM形成相关蛋白关系密切,因此我们推测HMGA2可能影响VM的形成,进而导致胃癌的不良预后。2.HMGA2与EMT及肿瘤细胞干性相关,且促进EMT的发生,并增加肿瘤细胞干性标记物的表达。3.在体外,HMGA2促进胃癌细胞的迁移、侵袭、增殖、克隆形成和管道形成;在体内,HMGA2促进肿瘤的生长及VM形成。4.Twist1是HMGA2的靶基因,Twist1的下调部分削弱HMGA2介导的对VM的促进作用及对肿瘤细胞迁移的促进作用。5.HMGA2通过直接结合Twist1的启动子区域增强Twist1的转录,并上调VE-cadherin的表达,进而促进VM的形成。