Toll样受体（Toll-like receptor，TLRs）是固有免疫系统中能识别病原体相关分子模式的模式识别受体（PRR）之一，在识别病原微生物高度保守的结构分子中起到很关键的作用。每种TLRs能识别不同的微生物分子，其中能识别核酸的包括：TLR3，7，8和9，而且自身核酸也保留了活化TLRs信号的能力。当免疫细胞接受到不当刺激时，会引发自身免疫性疾病。当细胞处于稳定状态时，大多数TLR7/9表达在内质网中，当细胞受到病毒侵袭时，内质网中的多跨膜蛋白Unc93B1负责将TLR7/9从内质网转移到内体中，在内体中分裂成有活性的受体，与配体结合，启动下游信号通路。CCT-ODN是一种模拟人类微卫星DNA的含有8个CCT重复单位的脱氧寡核苷酸（ODN），前期工作表明：该ODN是一种抑制性ODN，对TLRs的抑制作用具有选择性，表现为不抑制TLR3和TLR4的活性，对TLR9的抑制能力强于TLR7，然而，CCT-ODN是如何抑制TLR7/9的活性尚不清楚。有文献报道：位于内质网上的多跨膜蛋白Unc93B1对TLR7和TLR9的运输具有选择性，野生型的Unc93B1优先运输TLR9，而D34A突变型的Unc93B1优先运输TLR7。由此我们提出一个假设：CCT-ODN可能是通过影响Unc93B1的移行而发挥对TLR7/9胞内移行及活性的抑制作用。为了研究CCT-ODN是否对TLR7/9细胞内移行有影响，本研究采用间接免疫荧光染色技术检测CCT-ODN对TLR7/9细胞内移行的影响，并观察了CCT-ODN对TLR7/9及下游信号通路相关分子基因表达的调控作用，进一步检测了CCT-ODN对TLR9非依赖途径的胞浆内DNA感知蛋白基因表达的影响。1. CCT-ODN对配体诱导的TLR7和TLR9的胞内移行的影响为了研究CCT-ODN对TLR7和TLR9胞内移行是否有抑制作用，我们采用人源pDCs细胞系CAL-1细胞作为靶细胞，用CCT-ODN与对照ODN作用于细胞2hours，以间接免疫荧光技术对TLR7或TLR9和内质网分别进行蛋白定位，用Alexa Fluor488结合的荧光抗体标记内质网，Alexa Fluor555结合的荧光抗体标记TLR7/9，通过共聚焦显微镜（Olympus FV500）呈像，结果显示：TLR7和TLR9能组成性表达在CAL-1细胞的内质网中，与对照组相比，在各自配体的诱导下，TLR7和TLR9都能从内质网中移行出来，与配体诱导组相比，CCT-ODN却能抑制配体诱导的TLR7和TLR9的细胞内移行，而与CCT-ODN的序列具有相同长度和修饰的MS19对配体诱导的TLR7和TLR9的细胞内移行没有影响，以上结果表明：CCT-ODN对TLR7和TLR9的细胞内移行有抑制作用。2. CCT-ODN对TLR7/9配体诱导的Unc93B1胞内移行的影响为了进一步研究CCT-ODN如何抑制TLR7/9的胞内移行，根据CCT-ODN抑制TLRs的选择性以及Unc93B1运输TLR7/9的偏爱性，我们推测CCT-ODN可能会影响运输蛋白Unc93B1，本研究首先采用间接免疫荧光技术对Unc93B1和内质网进行对照染色，用Alexa Fluor488结合的荧光抗体标记内质网，Alexa Fluor555结合的荧光抗体标记Unc93B1，通过共聚焦显微镜呈像，结果显示：与对照组相比，TLR7和TLR9各自的配体都能诱导Unc93B1的胞内移行，Unc93B1会在TLR7/9配体的诱导下与TLR7（TLR9）一起离开内质网，对配体组相比，CCT-ODN对配体诱导的Unc93B1的胞内移行有抑制作用，MS19对Unc93B1的胞内移行没有影响。表明CCT-ODN能抑制TLR7/9配体诱导的Unc93B1的胞内移行。3. CCT-ODN不能靶向Unc93B1，也不能与内质网相互作用为了进一步研究CCT-ODN是如何抑制Unc93B1的胞内移行，本研究采用红色荧光Cy3标记CCT-ODN，检测Cy3-CCT-ODN与Unc93B1的共定位情况，结果表明Cy3-CCT-ODN与对照Cy3-MS19均不能与Unc93B1结合，说明CCT-ODN不是通过直接结合Unc93B1而抑制其移行。除了Unc93B1之外，是否能与内质网上其它蛋白结合仍不清楚，接着对CCT-ODN与内质网进行定位，结果显示CCT-ODN不能靶向内质网，说明CCT-ODN抑制TLR7/9和Unc93B1的靶点不在内质网上。4. CCT-ODN能显著上调TLR7/9的表达水平因为CCT-ODN能抑制TLR7/9和Unc93B1的胞内移行，是否会影响TLR7/9和Unc93B1的表达水平？为了揭示CCT-ODN对TLR7/9表达水平的影响，我们通过相对定量PCR法检测CCT-ODN对TLR7/9的表达水平的影响，结果表明CCT-ODN在作用于细胞2hours后能够显著上调TLR7/9的表达，这种上调可能是为了补充内体中的TLR7/9。而且CpG2006作为TLR9的配体对细胞有刺激作用，但是能显著上调抑制性细胞因子IL-10的表达水平，同时也从反面解释了CCT-ODN抑制TLR7/9运输，且上调其表达水平的合理性。5. CCT-ODN对CAL-1细胞表面TLR9表达的影响CCT-ODN能抑制CAL-1中TLR9的移行，但是又能显著上调TLR9的表达水平，当CCT-ODN抑制内质网中TLR9的移行时，不会活化下游的信号途径，可能细胞不需要启动上游TLR9的转录激活来补充TLR9，但是结果又表明CCT-ODN能上调TLR9的表达，推测新表达的TLR9不会全部积聚在内质网内，也可能会选择别的途径移行，也有相关文献表明在细胞表面能检测到TLR9，是否CCT-ODN诱导TLR9会选择与CpG ODN不同的移行途径，可能移行至细胞表面，为了解释这种可能性，我们采取间接荧光染色-流式细胞术检测CCT-ODN对CAL-1细胞表面TLR9的影响，从结果可以看出，静止的CAL-1细胞表面没有检测到TLR9，与空白对照组相比，TLR9的配体、CCT-ODN以及对照ODN（MS19）均不能诱导TLR9转移至CAL-1细胞表面，由此可见，CCT-ODN不会诱导TLR9选择转移至细胞表面的途径。6. CCT-ODN对TLR7/9介导的信号通路相关分子基因表达的影响为进一步探索CCT-ODN是如何抑制TLR7/9介导的固有免疫应答，本研究检测了CCT-ODN对TLR9介导的信号通路相关分子表达水平的影响。表明CCT-ODN能上调信号转导通路转录因子NF-κB和IRF-7及IFN-的表达，但是对TNF-没有显著影响。另外我们还检测了CCT-ODN对IRF-7信号通路上游相关分子基因表达的影响，主要包括STING依赖的DNA感知蛋白：DAI，Lrrfip1，IFI16，Trex1，对应还检测了CCT-ODN对STING非依赖的DNA感知蛋白AIM2和RNApoly III基因表达的影响。结果表明：与CCT-ODN显著上调TLR7和TLR9基因表达的趋势相比，CCT-ODN在作用于CAL-1细胞30minutes后能明显上调RNA pol III的基因表达，作用于细胞2hours后也能上调AIM2的基因表达，对胞浆内别的DNA感知蛋白的基因表达没有显著影响。7.变构的CCT-ODN对TLR9胞内移行的影响为了进一步探讨CCT-ODN对TLR9的胞内移行是否有序列依赖性，我们选用科室中通过在CCT-ODN的3’或5’末端和中间位置分别用AGGAGG或者AAGAAG替换CCTCCT，增加或减少CCT的数目自行设计了一系列变构CCT-ODN，观察这些变构的CCT-ODN序列对TLR9移行的影响，结果表明：(CCT)6-(AAG)2和(CCT)3-(AAG)2-(CCT)3对TLR9的移行有刺激作用，而(CCT)6-(AGG)2和(AGG)2-(CCT)6能显著抑制TLR9的移行，说明CCT-ODN不同的变构对TLR9胞内移行有不同的效应。8.变构CCT-ODN对STING依赖和非依赖信号途径相关分子表达水平的影响由于变构CCT-ODN对TLR9胞内移行的影响不一样，说明这些变构的CCT-ODN具有不一样的特性，那么对TLR7/9的表达水平会产生什么样的影响呢？为了阐明这一问题，我们通过实时相对定量PCR来检测变构CCT-ODN对TLR7/9表达水平的影响，结果表明：这些ODN对TLR7/9表达水平的影响趋势是一致的，但是抑制强度有所区别。同时我们也检测了对STING依赖和非依赖信号通路相关DNA识别蛋白表达水平的影响。结果显示：(CCT)2，(CCT)10，(CCT)4-(AAG)4，(AAG)2-(CCT)6，(CCT)3-(AAG)2-(CCT)3，(CCT)6-(AGG)2和(AGG)2-(CCT)6都能上调STING，说明这些变构的CCT-ODN能激活STING依赖的信号转导途径，而(CCT)2，(CCT)12，(CCT)4-(AAG)4能选择性地活化AIM2介导的STING非依赖信号途径。以上结果说明：CCT-ODN抑制TLR7/9介导的固有免疫应答可能是由于其抑制TLR7/9的胞内移行，从而导致内体缺乏TLR7/9，使pDCs无法启动保护性免疫反应，迫使pDCs采用两种途径来克服这种抑制：一是表达更多的TLR7/9，二是启动上游DNA感知蛋白通过IRF-7介导I型IFN等信号分子的表达。本研究的创新点在于：从TLR7/9的胞内移行和TLR7/9及其信号分子基因表达水平两方面揭示了CCT-ODN抑制TLR7/9活性的可能机制。