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类芽孢杆菌能分泌多种胞外抗菌物质,对多种致病菌有抑制活性,能显著提高动物的抗病性,随着科学研究的深入,类芽孢杆菌抗菌特性的应用将会得到重视。
采用双层琼脂平板法,从30份水样和2份猪粪样品中分离出12株具有抑菌活性的细菌,通过抗菌谱,筛选出一株分离自健康猪粪的类芽孢杆菌,名为NJ2008。通过菌落、菌体形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析,同时结合用微生物自动鉴定系统验证,鉴定这株菌属于爱媛类芽孢杆菌属(Paenibacillus ehimensis)。此菌细胞杆状,革兰氏染色成阴性,菌体中具有中生的椭园形芽孢,芽孢囊膨大;在普通琼脂平板上菌落乳白色,半透明,边缘光滑,呈白蜡状;在肉汤培养基中出现混浊且形成薄菌膜,最适生长温度为37℃,最佳生长酸碱条件pH6。
用双层琼脂平板法检测爱媛类芽孢杆菌,抗菌谱表明其对肠道致病菌有明显体外抑菌活性,能够抑制大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌的生长,也能够抑制水产动物病害的不动杆菌,迟缓爱德华菌和嗜水气单胞菌。除此之外,对革兰氏阳性细菌,猪链球菌2型、猪链球菌9型和马链球菌兽疫亚种也有抑制作用。
鉴于爱媛类芽孢杆菌NJ2008体外能够抑制鼠伤寒沙门菌,以人工感染的小鼠鼠伤寒沙门菌病为模型,分析爱媛类芽孢杆菌NJ2008对小鼠的急性毒性,并评估其预防和治疗小鼠感染沙门菌的效果。爱媛类芽孢杆菌NJ2008分别以107cfu/mL、108cfu/mL、109cfu/mL给小鼠灌胃,试验组和空白对照组小鼠均健康,证明 NJ2008对小鼠无毒性。以109cfu/mL爱媛类芽孢杆菌NJ2008预防人工感染鼠伤寒沙门菌小鼠,小鼠存活率为8/10(80%),空白对照组存活率仅为4/10(40%),试验组和空白对照组的差异显著,显示爱媛类芽孢杆菌NJ2008对小鼠感染鼠伤寒沙门菌有良好的预防效果。分别用106cfu/mL,107cfu/mL,108cfu/mL和109cfu/mL爱媛类芽孢杆菌NJ2008治疗人工感染鼠伤寒沙门菌小鼠,小鼠存活率分别为4/10(40%),4/10(40%),4/10(40%)和6/10(60%),空白对照组的存活率为4/10(40%),试验组和空白对照组无差异,治疗效果不佳。以上结果表明,爱媛类芽孢杆菌NJ2008能够抑制致病菌,可以作为一种微生物制剂用于预防动物的细菌疾病。
通过PCR扩增,从质粒pFPV25.1中荻取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pP43NMK的多克隆区,构建成pP43NMK-GFP,通过限制性核酸内切酶KpnⅠ与HindⅢ对所建质粒进行分析,并转化大肠杆菌,观察绿色荧光蛋白表达,证实成功构建了pP43NMK-GFP。该质粒可用于下一步转化爱媛类芽孢杆菌NJ2008,在动物体内定位爱媛类芽孢杆菌NJ2008。