【摘 要】
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鸭瘟病毒（Duck plaque virus,DPV）又名鸭肠炎性病毒（Duck enteritis virus,DEV）,它主要引起鸭、鹅、天鹅等雁形目禽类的传染性、致死性疾病。DPV基因组包含大量复制非必需区,可容纳多个外源基因的同时插入,且其宿主谱窄,具备发展成为载体疫苗的潜力。基于此,本研究以本实验室在鸡胚上连续传代致弱的鸭瘟病毒弱毒株CHa株为对象,构建了CHa株细菌人工染色体（Bact
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鸭瘟病毒（Duck plaque virus,DPV）又名鸭肠炎性病毒（Duck enteritis virus,DEV）,它主要引起鸭、鹅、天鹅等雁形目禽类的传染性、致死性疾病。DPV基因组包含大量复制非必需区,可容纳多个外源基因的同时插入,且其宿主谱窄,具备发展成为载体疫苗的潜力。基于此,本研究以本实验室在鸡胚上连续传代致弱的鸭瘟病毒弱毒株CHa株为对象,构建了CHa株细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）重组鸭瘟病毒并评价了其作为疫苗载体的潜力。本文主要研究内容和结果如下:1.DPV CHa株感染性克隆构建及稳定性试验首先构建了包含插入位点两侧同源臂、BAC载体功能序列mini-F和EGFP表达盒的转移载体,通过细胞内同源重组将其插入到DPV CHa株UL55基因内部,用挑斑和有限稀释的方法进行纯化,获得重组病毒CHa-Ins5-BAC。然后提取环化状态的重组病毒DNA并将其电转入E.coli GS1783中。通过PCR鉴定、RFLP分析,获得包含DPV CHa株全基因组的感染性克隆pDPV-CHa-BAC。在LB/Cm平板上连续传代20次并每隔5代进行一次遗传稳定性检测,结果表明pDPV-CHa-BAC遗传特性稳定,可以作为DPV基因操作的平台。2.DPV CHa株感染性克隆的全基因组测定及分析将感染性克隆pDPV-CHa-BAC质粒进行二代测序并进行序列拼接,获得pDPV-CHa-BAC的全基因组序列。在NCBI上通过BLAST与减毒疫苗株DPV C-KCE和Vac进行序列比较分析,发现pDPV-CHa-BAC与C-KCE和Vac相比序列相似性分别为99.98%和99.96%,GC含量都为45%;三株病毒ORF都为77个,病毒全基因组高度同源。表明BAC的插入不会造成DPV CHa基因组产生较大的遗传突变,具备作为构建载体疫苗平台的潜力。3.DPV CHa株感染性克隆拯救及生物学特性研究将感染性克隆pDPV-CHa-BAC DNA转染DEF获得拯救的重组病毒rDPV-CHa-BAC,经PCR和IFA鉴定重组病毒构建成功。通过一步法生长曲线研究亲本株DPV CHa和拯救重组病毒rDPV-CHa-BAC的生长特性发现,随着时间的增长,病毒量逐渐升高,重组病毒与亲本株一步法生长曲线相似,无显著性差异。在多步法生长曲线中,重组病毒rDPV-CHa-BAC的滴度在24～96 h显著低于亲本株DPV CHa。4.重组病毒rDPV-CHa-BAC在鸭胚中的感染特性分析用10~4、10~5、10~6TCID50剂量的rDPV-CHa-BAC、CHa、CHv感染鸭胚,除10~4TCID50的rDPV-CHa-BAC感染组全部存活之外,其余组别均发生不同程度的死亡,其中CHv和CHa接毒组死亡率达到100%。相比之下,强毒株CHv株感染鸭胚出现死亡的速度更快。将108.63 copies/0.2 m L的重组病毒rDPV-CHa-BAC和CHa感染鸭胚进行病毒增殖、安全性和先天免疫水平检测。结果显示,rDPV-CHa-BAC和CHa感染鸭胚的肝脏、脑、尿囊液中均可检测到病毒的复制,表明在DPV UL55基因内部插入BAC载体序列不影响重组病毒rDPV-CHa-BAC在鸭胚上的复制。接种1 d、3 d、5 d后,各组均能引起引起肝脏和脑组织产生显著病变,且其病变程度随着接毒时间延长不断加重。鸭胚的脑和肝脏组织中的部分天然免疫相关基因的转录水平随着时间增加表现出上调趋势,表明病毒基因组的复制能诱导胚胎中天然免疫抗病毒反应的发生。
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