目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的微血管并发症,也是糖尿病患者致残与死亡的重要因素之一。DN的主要病理特征是肾小球细胞外基质堆积、系膜增宽、基底膜增厚,肾小球硬化及肾间质纤维化。近几年的研究显示,肾小球滤过屏障结构和功能的改变,尤其是作为肾小球滤过屏障重要组成成分的足细胞损伤,在糖尿病肾病的进展中发挥了重要作用。足细胞附着于肾小球基底膜外侧,是一种高度特异性的终末分化细胞,参与构成肾小球滤过屏障的最外层,对蛋白的滤过及维持滤过屏障成分的更新起着举足轻重的作用。在DN的发生发展中,足细胞的病理改变主要包括正常形态消失、胞体肥大或萎缩、空泡化、胞浆中脂滴形成、足突增宽融合、足细胞数目减少等。但是,足细胞损伤的具体机制尚不清楚,有研究显示,细胞骨架蛋白的改变参与了足细胞的损伤过程。Nestin是一种属于第Ⅵ类中间丝的细胞骨架蛋白,表达于多种组织的干细胞或前体细胞中,被广泛用作干细胞的标志性蛋白。除维持细胞的正常形态,nestin还具有抗凋亡作用。抑制细胞中nestin的表达,可以增强过氧化氢(H202)刺激诱导的神经前体细胞和血管平滑肌细胞的凋亡,而将野生型的nestin (nest-1893)转入到细胞内可起到保护作用,显著减少H202诱导的细胞凋亡。研究发现,nestin表达于鼠和人发育成熟的肾脏足细胞中,对维持足细胞的形态和功能具有重要作用。抑制nestin的表达,能显著降低体外培养足细胞足突的数量。而在IgA肾病、局灶阶段性肾小球硬化等肾脏疾病中,nestin表达的降低同蛋白尿密切相关。在糖尿病肾病中,nestin表达的情况目前尚未有明确报道。在糖尿病肾病中,足细胞凋亡是引起肾小球足细胞数目减少、肾组织损伤、蛋白尿和肾功能降低的重要原因。Nestin在糖尿病足细胞损伤和凋亡过程中起何种作用目前尚不清楚。本研究拟通过建立糖尿病大鼠模型和体外培养条件性永生化足细胞,探讨nestin在糖尿病肾小球足细胞损伤中的作用及机制,为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制及其防治提供理论依据。方法：1中间丝蛋白Nestin在糖尿病大鼠肾组织的表达Wistar大鼠随机分为2组：对照组(Control)和糖尿病组(Diabetes mellitus, DM)。DM组大鼠按65mg/kg体重腹腔注射STZ(溶于0.1M的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,pH4.5),对照组大鼠注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。48h后测定血糖和尿糖,血糖≥16.7mmol/L且尿糖阳性者(+++-++++)作为糖尿病(DM)大鼠。分别于成模后4、8、12、16周,每组各取5只大鼠,留取24h尿液和血清后,处死大鼠切取肾脏。部分肾组织分别置于4%多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定,用于光镜、免疫组织化学和电镜检测；部分肾脏皮质用于分离肾小球,提取肾小球总RNA和蛋白。免疫组织化学和Western blot检测肾小球内nestin、 p-nestin、vimentin、 Cdk5/p35蛋白的表达；免疫荧光双染色检测nestin与vimentin、 Cdk5、 WT1、 α-SMA、 synaptopodin、 laminin等的共同表达情况；免疫共沉淀检测nestin与vimentin蛋白的结合情况；Real-time PCR检测肾小球中nestin、 vimentin和Cdk5m RNA的表达。2高糖对体外培养小鼠足细胞Nestin表达的影响条件性永生化足细胞在33℃, γ-IFN存在的许可条件下培养传代后,于37℃,无γ-IFN的非许可条件下培养10-14天,促进细胞分化成熟。免疫荧光化学检测synaptopodin观察足细胞成熟情况。取培养10天后的足细胞,分成3组：正常糖组(5.5mM, Normal glucose, NG);正常糖+甘露醇组(5.5mM glucose+24.5mM mannitol, NG+M);高糖组(30mM, High glucose, HG)。分别刺激6、12、24、48、72h后收集3组细胞,提取细胞总蛋白和总RNA。采用免疫细胞化学检测nestin、 vimentin、 Cdk5在足细胞中的表达；免疫荧光双染色和免疫共沉淀检测nestin与vimentin的共表达情况；Western blot检测nestin、 p-nestin、 vimentin、 Cdk5/p35的表达；Real-time PCR检测nestin、 vimentin和Cdk5的mRNA水平。3抑制Cdk5对高糖刺激足细胞Nestin表达的影响①动物实验：Wistar大鼠随机分为4组：正常对照组(Control组),糖尿病组(DM组),糖尿病+DMSO组(DM+D组),糖尿病+Roscovitine组(DM+R组)。应用STZ腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。动物成模后,DM+R组每日按2.8mg/kg腹腔注射Roscovitine (溶于400μl DMSO中)；DM+D组每日腹腔注射400μl DMSO。给药后16周,收集各组大鼠24h尿和血清,处死大鼠后切取肾脏。部分肾组织经4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定,用于形态学观察和免疫组化检测；部分肾组织用于肾小球分离,提取总RNA和总蛋白。应用免疫组化、Western blot检测nestin的表达。②细胞实验：体外培养小鼠条件性永生足细胞,将37℃培养10天的足细胞分为4组：正常对照组(NG组),高糖组(HG组),高糖+Cdk5siRNA组(HG+C-siRNA组),高糖+Negative siRNA组(HG+N-siRNA组)。分别刺激48h后收集细胞,提取总蛋白,应用免疫细胞化学和Western blot检测nestin的表达。4抑制nestin表达对高糖诱导小鼠足细胞凋亡的影响采用CaCl2法制备DH5a感受态,将构建的nestin miRNA质粒转化感受态细胞,摇菌扩增后大量提取。miRNA质粒转染足细胞抑制细胞内nestin的表达。37℃非许可条件下培养10天的足细胞随机分为5组：正常糖对照组(NG组)、甘露醇组(M组)、高糖组(HG组)、高糖+nestin miRNA组(HG+miRNA组)、高糖+Scrambled miRNA阴性对照组(HG+Scrambled组)。分别刺激24、48h后收集细胞。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测Bcl-2、 Bax和cleaved caspase-3的表达。结果：1中间丝蛋白Nestin在糖尿病大鼠肾组织的表达①光镜观察：DM组大鼠从第4周开始,肾小球出现体积增大,细胞数增多,至第16周时,系膜区出现明显增宽,系膜细胞和基质增多；肾小管上皮细胞自第4周开始出现细胞水肿和小灶状萎缩。②免疫荧光检测显示,在正常肾组织中,nestin只表达在肾小球中,位于基底膜外侧,与足细胞标志性蛋白WT1和synaptopodin有共定位表达,说明nestin表达于足细胞中,并且与vimentin和Cdk5在足细胞中有共定位表达。③免疫组化显示,正常肾组织中nestin和vimentin主要表达于肾小球中。图像分析结果显示,与对照组相比,DM组大鼠nestin的表达在4-8周时明显增强(p<0.05), vimentin的表达在第4周时明显增强(p<0.05),至第16周时nestin和vimentin的表达均显著降低(p<0.05)。DM组大鼠肾小管上皮细胞中自第4周开始,部分出现nestin和vimentin的表达。免疫荧光检测显示, nestin与vimentin及α-SMA在肾小管中有共定位表达。④-Western blot结果表明,与对照组相比,DM组nestin蛋白的相对表达量在第4、8周时显著高于对照组,vimentin的表达在第4周时显著高于对照组,而后随病情进展两者均逐渐降低(p<0.05)。 Cdk5/p35蛋白的相对表达量随病情的进展在肾小球中则逐渐升高(p<0.05)。DM组p-nestin (Thr-316)的表达水平在第4周时略有降低,而后随病情进展逐渐升高(p<0.05)。免疫共沉淀显示,与对照组相比,nestin与vimentin的聚合随病情进展逐渐减少。⑤Real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,DM组大鼠nestin mRNA的表达水平在第8周时达到最高(p<0.05), vimentin mRNA的表达水平在第4周时达到最高；而Cdk5mRNA的表达水平随病情进展逐渐升高(p<0.05)。2高糖对体外培养小鼠足细胞Nestin表达的影响①足细胞培养结果显示,在33℃,γ-IFN存在的许可条件下培养,足细胞呈梭形或三角形,细胞接触融合后呈鹅卵石样。在37℃,无γ-IFN的非许可条件下培养10-14天后,足细胞胞浆展开,伸出大量足突,呈树枝状。免疫荧光检测显示,未分化足细胞中无synaptopodin的表达,分化10天后,足细胞中synaptopodin的表达明显增强,提示足细胞已分化成熟。②免疫细胞化学检测结果显示,nestin、 vimentin和Cdk5均表达在足细胞浆内。高糖刺激后,与对照组相比,足细胞内nestin和vimentin的表达均逐渐降低,至48h后,nestin的表达明显减弱；Cdk5的表达在高糖刺激后逐渐增高。③Western blot结果显示,与对照组相比,HG组足细胞中nestin和vimentin的表达均逐渐降低(p<0.05),至48h后,nestin的表达几乎检测不到；Cdk5/p35蛋白的表达水平在高糖刺激后逐渐升高,至72h达到最高(p<0.05)。与对照组相比,足细胞中p-nestin (Thr-316)的表达水平在高糖刺激后逐渐升高,24h时达最高。④免疫荧光双染色显示,足细胞中nestin和vimentin有共定位表达,呈丝状分布,高糖刺激后,两者的共定位表达减少；免疫共沉淀结果显示,与对照组相比,高糖刺激后nestin与vimentin的聚合逐渐降低(p<0.05),48h后几乎完全解聚。⑤Real-time PCR结果显示,高糖组nestin和vimentin mRNA表达显著降低(p<0.05),72h后分别达到对照组的0.19±0.07倍和0.16±0.01倍；高糖组Cdk5的表达则显著升高(p<0.05),72h达到对照组的3.75±0.12倍。3抑制Cdk5对高糖刺激足细胞Nestin表达的影响①Roscovitine处理后,能明显减轻DM组大鼠肾小球基底膜增厚,系膜区增宽及足细胞足突融合等病理改变,并对DM大鼠肾功能有一定的改善,BUN和尿ALB有明显降低(p<0.05)。但对血糖、体重肾重比等指标没有影响。②免疫组化结果显示,与DM组和DM+D组相比,Roscovitine处理的DM大鼠肾小球中nestin的表达明显增强,但低于对照组(p<0.05)。③Western blot检测结果显示,DM+R组肾小球中nestin的表达明显高于DM组和DM+D组,但低于正常对照组(p<0.05)。④免疫细胞化学结果显示,以siRNA抑制Cdk5表达,HG+C-siRNA组足细胞中nestin的表达程度要强于HG组,但低于正常对照组。⑤Western blot结果显示,HG+C-siRNA组足细胞中nestin蛋白的相对表达水平高于HG组和HG+N-siRNA组(p<0.05)。4抑制nestin表达对高糖诱导小鼠足细胞凋亡的影响①质粒效果鉴定结果显示,所构建的4组干扰质粒中,第4组质粒的抑制效果最好,可以达到90%。抑制实验均采用第4组质粒。免疫细胞化学检测结果显示,转染第4组干扰质粒后,足细胞中nestin的表达明显降低。②MTT结果显示,高糖刺激后足细胞的存活率逐渐降低,72h后足细胞存活率降至75%,显著低于正常对照组(p<0.05)。与Scrambled质粒转染组相比,nestin miRNA转染组在高糖刺激后,足细胞存活率显著降低(p<0.05)。③TUNEL和流式细胞术凋亡检测结果显示,与NG组和M组相比,HG组足细胞的凋亡率明显增高(p<0.05)。在抑制nestin表达后,nestin miRNA转染组高糖刺激引起的足细胞凋亡比例显著高于未转染组和Scrambled组(p<0.05)。④Western blot结果显示,与NG组和M组相比,HG组足细胞Bcl-2蛋白的表达明显降低,而Bax的表达明显增高,Bcl-2/Bax值在HG组也显著降低(p<0.05)。与未转染组和Scrambled组相比,nestin miRNA组Cleaved caspase-3蛋白的表达在高糖刺激后,随时间延长显著增高(p<0.05)。结论：①正常肾组织中,细胞骨架中间丝蛋白nestin只表达在肾小球足细胞中,在肾小管上皮细胞和肾间质细胞中无表达。在糖尿病大鼠肾小球中,随病情进展,nestin和vimentin的表达均先升高后降低,两者间的聚合水平逐渐降低。②高糖刺激可以降低体外培养小鼠足细胞中nestin和vimentin的表达,并降低两者间的聚合水平。③腹腔注射Cdk5抑制剂,可以减轻糖尿病大鼠肾脏损伤及肾小球中nestin表达降低程度；应用siRNA抑制Cdk5的表达,可以减轻高糖刺激导致的体外培养足细胞中nestin的降低。④高糖刺激可诱导足细胞凋亡,应用]miRNA抑制nestin表达,能显著增加高糖刺激诱导的足细胞凋亡,提示nestin对足细胞有保护作用,高糖刺激导致的足细胞凋亡可能是通过降低nestin表达实现的。综上,本研究提示中间丝蛋白nestin在糖尿病足细胞的损伤和凋亡中发挥了作用,Cdk5可能参与了这一过程。